混合烴污染土壤微生物-電動修復中的互補性研究

范瑞娟，郭書海，李鳳梅，吳 波

（1.北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，沈陽 110016；3.國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021）

在復雜的石油烴成分中，烷烴（包括環烷烴）以及多環芳烴分布最廣，所造成的環境問題也最嚴重[1]。生物修復技術操作簡單、處理費用低、對環境影響小，因而在石油烴類污染土壤的修復中被廣泛應用[2-6]。微生物作為生物修復的功能主體，其種類、群落組成、活性、數量等對有機物的去除效率和生物利用途徑起著決定性作用。不同的微生物所包含的酶系及其代謝途徑不同，因而所能利用的污染物種類也不同，而石油烴組成成分復雜，需要將不同種類的菌株進行混合，制成微生物降解菌群，以實現石油烴不同組分最大程度的去除[7-8]。土壤pH和營養物質的比例對微生物生長有重要作用，從而對污染物生物降解產生重要影響，因而有必要對土壤環境條件進行優化，以提高微生物的活性和數量[9-10]。污染物結構組成和性質直接決定了其生物可利用性，然而，由于石油烴類污染物的生物可利用性很差，僅憑微生物修復技術很難實現其高效去除[11]。近年來，人們開始使用微生物-電動耦合技術以提高土壤中頑固性有機物，如石油烴的去除[12-14]。

電動技術對土壤的修復作用依賴于一系列的電化學過程，包括電遷移、電滲析、電泳以及電化學氧化在土壤中所誘導的氧化還原反應[15-16]。對于石油烴這種難遷移的疏水性有機物，在電場作用下主要依靠電化學氧化的方式得以去除[17]，且在一定的范圍內，電化學反應區域隨電場強度的增大而擴大，從而使污染物的去除率得以提高[18]。另外，在電動處理過程中，土壤中的營養物質、電子受體、微生物等的遷移率得以促進，進而使污染物的生物可利用性得到加強[19-20]。另有研究表明，在電極附近水的電解作用會導致極端pH的發生和土壤含水率的變化，對微生物的生長具有負面影響。如，Lear等[21]研究發現，電場的施加導致陽極區域土壤酸化，使得可培養細菌和真菌的數量均有所降低，最終削弱了污染物降解效率。然而，周期性切換電極極性可消除土壤含水率和pH的大幅變化，降低對微生物的危害[22-24]。

目前，由于缺乏直接的監測手段，大多數的研究都集中在電場對生物降解的影響方面，而對電化學反應的研究較少，但間接的證據已證明了電化學反應在持久性污染物的去除方面所起的重要作用[25-26]。在微生物-電動聯合修復中，污染物的去除不僅依賴于微生物的降解作用，還在很大程度上依賴于電化學氧化作用[27-31]。然而，微生物降解和電化學氧化分別在去除不同石油烴組分時的具體作用還不明確。

本文分別以正十六烷、環十二烷和芘作為直鏈烷烴、環烷烴和多環芳烴的代表性污染物，以三者所組成的混合有機污染物為研究對象，在二維對稱電場修復平臺上，采用電動修復（EK）、微生物修復（BIO）和微生物-電動聯合修復（BIO-EK）的方式，通過分析不同修復方式中不同烴類污染物降解的時空特征和微生物數量、活性變化，探討微生物降解和電化學氧化分別在去除不同石油烴組分時的具體作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗土壤

試驗土壤采自中國科學院沈陽生態實驗站附近（41°31′0.19″N，123°22′8.77″E）0~30 cm 土壤，其部分理化性質見表1。使用前將土壤自然風干并過篩（<2 mm）。

表1 土壤理化性質初始值Table 1 Initial characteristics of the test soil

1.1.2 污染物

分別以正十六烷（純度>98%，東京化成工業株式會社）、環十二烷（純度>99%，東京化成工業株式會社）和芘（純度>99%，百靈威科技有限公司）作為直鏈烷烴、環烷烴和多環芳烴的代表性污染物。將正十六烷、環十二烷和芘混入土壤中，使其最終濃度分別為4 744.54、947.22 mg·kg-1和 48.81 mg·kg-1，室溫狀態下平衡一周。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：5 g·L-1牛肉膏，10 g·L-1蛋白胨，5 g·L-1NaCl，pH 7.0~7.2。

無機鹽培養基：1.5g·L-1NaNO3，1.5g·L-1（NH4）2SO4，1.0 g·L-1K2HPO4，0.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.5 g·L-1KCl，0.01 g·L-1FeSO4·7H2O，0.002 g·L-1CaCl2，pH 7.0。

1.1.4 降解菌

以前期所構建的微生物降解菌群為供試微生物，該降解菌群包含直鏈烷烴、環烷烴和芳烴降解能力的6 株菌 B1、B2、B3、B6、B7和 B9，其中 B2和 B3對直鏈烷烴、環烷烴和芳烴均具有降解能力，B1、B6、B7和 B9對直鏈烷烴和環烷烴具有降解能力，初步鑒定B1、B2、B6和B7分別屬于 Hydrogenophaga sp.、Phenylobacterium sp.、Sphingobium sp.和Bacillussp.，B3和B9屬于Arthrobacter sp.[32]。將細菌活化后，接入到牛肉膏蛋白胨培養基中，用 10 L發酵罐發酵培養（150 r·min-1、35℃），3 d后用低溫離心機（4℃）進行離心（8000 r·min-1、2 min），將離心所得菌體懸浮于無機鹽培養基中備用。

1.2 試驗設計及試驗裝置

試驗裝置如圖1所示，包括土壤室（100 cm×100 cm×25 cm）、25根圓柱形不銹鋼電極（20 cm×1 cm）、直流電源、溫度探頭、pH計、控制系統和實時監測系統。25根電極以矩陣的形式排列，電極間距為20 cm；控制系統可對電極極性按設定的時間間隔進行陰陽極極性的切換，并可將電極極性以行/列轉換的形式進行旋轉切換，以此形成一個二維的對稱電場；監測系統可對土壤溫度、pH等參數進行實時監測。

試驗設計如表2所示。其中BIO-EK和EK在圖1所示的裝置中進行，施加的直流電場為1.0 V·cm-1，每5 min切換一次電極極性，每10 min進行一次行與列之間的轉換。土壤中所投加的微生物比例和數量以及土壤pH和C∶N∶P等均按照前期試驗結果來確定[32]。BIO-EK和BIO污染土壤中按照前期試驗所確定的比例 （B1∶B2∶B3∶B6∶B7∶B9=1∶1∶2∶0.5∶1∶2） 及接種量（2%）投加微生物混合菌群后測得的可培養細菌數量為 1.0×106CFU·g-1干土；調節土壤 pH 為 7.0；綜合考慮土壤中污染物、有機碳、速效氮和速效磷的濃度，調節C∶N∶P 為 100∶5∶1，其中 N 由 NaNO3和（NH4）2SO4提供，P由K2HPO4提供。用蒸餾水調整土壤的含水量至20%，試驗過程中，定期向土壤箱中噴灑蒸餾水以保持該含水量。將土壤分層鋪放在土壤室內并壓實，每個土壤室中約100 kg。采樣點根據電場強度分布，每10 d從圖2所示位置（a點：電極處；c點：兩電極中間；e點：對角線中心）進行采樣，將各相同位點的土樣混勻后測定相應指標，試驗共進行100 d。

圖1 試驗裝置Figure 1 Schematic of the experimental set-up

圖2 采樣點分布等高線圖Figure 2 Contour plots signifying the distribution of sampling positions

式中：C0為污染物初始含量；Ct為降解后的污染物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤中正十六烷、環十二烷以及芘含量的測定

土壤中正十六烷、環十二烷和芘的含量采用氣相色譜法測定[32]。

1.3.2 正十六烷、環十二烷和芘降解率的計算

正十六烷、環十二烷和芘的降解率按照下面公式進行計算：

表2 試驗設計Table 2 Experimental protocol

實際降解率=處理組降解率-對照組降解率

1.3.3 脫氫酶活性分析

脫氫酶活性根據 TTC（2，3，5-Triphenyl TetrazoliumChloride，2，3，5-氯化三苯基四氮唑）還原法測定[33]。其原理是TTC在細胞呼吸過程中接受氫以后，可以還原為紅色的 TPF（Triphenyl Formazan，三苯基甲臜），TPF在485 nm處存在吸收峰。

1.3.4 可培養細菌數量變化

可培養微生物數量分析采用平板菌落計數法[34]。準確稱取1 g土樣，置于9 mL無機鹽培養液中，140 r·min-1振蕩6 h。吸取1 mL菌液，用滅菌的去離子水進行梯度稀釋，直至合適的濃度。分別取各稀釋濃度的菌液100 μL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，待菌液滲透入培養基內，將培養皿倒置于30℃恒溫培養箱內，48 h后統計菌落數量，計算每克土壤中菌落數量（CFU·g-1土）。

1.4 數據處理

圖形繪制采用 SigmaPlot 10.0（Systat Software，USA）；方差分析采用 SPSS 17.0（SPSS Software,USA）中“Duncan”法。

2 結果與討論

2.1 土壤中正十六烷、環十二烷和芘的降解

2.1.1 正十六烷、環十二烷和芘含量的變化

圖3為不同處理組中正十六烷、環十二烷和芘含量隨時間和空間的變化情況。100 d后，除對照組外，各處理方式下正十六烷、環十二烷和芘的濃度均有明顯的下降，且各污染物最大去除均發生在BIOEK處理組中。在試驗進行的前10 d，各污染物降解速率最快。

EK處理中，在未添加降解菌，也未進行土壤條件優化的情況下，正十六烷、環十二烷和芘也發生了明顯的降解。由于極強的疏水性，這類有機污染物很難通過電滲析、電遷移和電泳的方式得以去除，而當土壤中存在“微導體”，即具有電子傳導特性的粒子（如金屬氧化物等）時，在外加電場的情況下，這些粒子能夠誘使污染物發生電化學反應[35]。因此，間接說明EK中污染物的去除在很大程度上依賴于電化學氧化作用。各污染物最大去除均發生在BIO-EK處理組中，說明在BIO-EK處理過程中，污染物的降解依賴于微生物降解和電化學氧化的聯合作用。所添加的微生物降解菌群包含直鏈烷烴、環烷烴和芳烴降解能力的不同菌株，其綜合了不同菌在降解石油烴不同組分過程中所體現出的優勢，可實現不同菌株代謝途徑的互補。前10 d污染物降解速率最大，后期則逐漸降低。對于EK而言，可能由于初期土壤中積累的中間產物較少，污染物去除速率較大，而隨著中間產物的積累，使得污染物去除速率逐漸降低。對于BIO-EK和BIO而言，除以上原因之外，還可能由于菌群和營養物質的添加解決了土壤中微生物活性低下和營養缺乏的問題，使得前10 d污染物降解速率最大，后期隨著營養物質的消耗使得微生物活性和數量降低，從而導致污染物去除緩慢[36]。

2.1.2 不同位點正十六烷、環十二烷、和芘降解率隨時間變化

圖4表示不同采樣點（a點、c點和e點）土壤中正十六烷、環十二烷和芘降解率隨時間的變化情況。

由圖4A、圖4D、圖4G可知，100 d后，BIO-EK中a點、c點和e點正十六烷降解率分別為79.0%、75.7%和71.4%，EK中a點、c點和e點降解率分別為38.1%、30.6%和25.4%，而BIO中的平均降解率為40.9%。進一步說明，在BIO-EK處理過程中，污染物的降解依賴于微生物降解和電化學氧化的聯合作用，而結合EK和BIO中正十六烷的降解率，可推知在BIO-EK修復中，對于正十六烷的去除，微生物降解的貢獻大于電化學氧化作用，并且可以看出，EK中正十六烷的降解率隨電場強度的減弱而逐漸降低，由此說明電化學氧化作用的貢獻率隨電場強度的減弱而逐漸降低。在一系列脫氫酶的催化作用下，正十六烷被依次氧化成相應的醇、醛、酸，生成的正十六酸通過β-氧化的過程被繼續降解，而電場不僅可以促進正十六烷的單末端氧化，還可促進正十六酸的β-氧化過程[37]。這可能也是BIO-EK中正十六烷降解效率最高，并且電極附近電化學氧化的貢獻值較大的重要原因。

由圖4B、圖4E、圖4H可知，100 d后，BIO-EK中a點、c點和e點環十二烷降解率分別為93.9%、91.1%和86.8%，EK中a點、c點和e點降解率分別為51.6%、48.8%和44.2%，BIO中平均降解率為41.5%。表明在BIO-EK處理過程中，對于環十二烷的去除，電化學氧化的貢獻大于微生物降解作用。BIO-EK中環十二烷降解效率最高，并且電極附近電化學氧化的貢獻值較大，可能的原因是，電場可加速環十二烷的開環進程，使其轉換成易于被生物降解的線形物質[38]。

圖4 BIO、EK和BIO-EK土樣中不同采樣點（a、c和e）正十六烷、環十二烷和芘降解率隨時間的變化Figure 4 Degradation extent of n-hexadecane，cyclododecane and pyrene at different positions（a，c and e）in the BIO，EK and BIO-EK tests

由圖 4C、圖 4F、圖 4I可知，100 d后，BIO-EK 中a點、c點和e點芘的降解率分別為87.9%、82.9%和78.0%，EK中a點、c點和e點降解率分別為43.0%、36.7%和32.4%，BIO中的平均降解率為44.4%。表明在BIO-EK處理過程中，對于芘的去除，微生物降解的貢獻大于電化學氧化作用，尤其在場強較弱的c點和e點。該結果與Huang等[28]的研究結果相似，其研究是以1-D電場為修復平臺，以單一污染物芘為研究對象進行的。

綜上，在微生物-電動聯合修復過程中，微生物降解和電化學氧化在不同污染物的去除中體現出了互補性，其中正十六烷和芘的去除較多地依賴于微生物的降解作用，而環十二烷的去除則較多地依賴于電化學氧化作用。且微生物降解作用在場強較弱的位點貢獻較大，而電化學氧化作用在場強較強的電極附近貢獻較大。

2.2 脫氫酶活性和可培養細菌數量的變化

脫氫酶活性是表征微生物活性的一個重要指標，是生物細胞內催化有機物氧化（脫氫），并將電子傳遞給最終電子受體的氧化還原酶，而這個電子傳遞的過程是土壤微生物呼吸途徑的一個重要部分[39]。因此，本研究選擇脫氫酶作為評價土壤微生物活性的指標。

BIO-EK和BIO處理中，土壤脫氫酶活性和可培養細菌數量隨時間和空間變化情況如圖5所示。BIO-EK處理組中，前期脫氫酶活性和細菌數量逐漸上升，至40 d達到最大值，而后則逐漸下降，但100 d后脫氫酶活性和細菌數量仍高于初始值。a點、c點和e點之間脫氫酶活性和細菌數量均沒有顯著性差異（P>0.05）。BIO處理組中，10 d時脫氫酶活性和細菌數量達到最大（P<0.01），隨之逐漸降低至與初始脫氫酶活性和細菌數量相似。整體來看，BIO-EK中脫氫酶活性和細菌數量明顯高于BIO中（P<0.01）。

圖5 BIO-EK及BIO處理土壤中脫氫酶活性和可培養細菌數量變化Figure 5 Changes of dehydrogenase activity and culturable bacterial numbers in the BIO-EK and BIO tests

可能由于試驗初期對土壤中營養物質的比例和pH進行了調節，土壤環境有利于微生物的生長，從而使得前期脫氫酶活性和細菌數量逐漸上升，隨著營養物質的消耗，導致脫氫酶活性和細菌數量的降低。由于電場方向的周期性改變，使得土壤中不同位點pH均一，營養物質分散均勻，故脫氫酶活性和細菌數量在空間上沒有明顯的差異[40]，與前期研究結果一致[31]。BIO-EK中脫氫酶活性和細菌數量高于BIO中，可能的原因是，當向土壤中施加電場時，陽極附近由于水的電解作用所產生的氧氣會促進微生物細胞的呼吸速率，并間接提高土壤氧化還原水平，從而引起微生物活性和數量的增加[41]，且電場方向的周期性改變增強了微生物與營養物質之間的傳質性[42]，也有可能引起微生物活性和數量的增加。

3 結論

在微生物-電動聯合修復混合烴污染土壤的過程中，微生物降解作用和電化學氧化作用在不同烴類成分的去除中表現出較為明顯的互補性，其中正十六烷和芘的去除較多地依賴于微生物的降解作用，而環十二烷的去除則較多地依賴于電化學氧化作用，且微生物降解作用在場強較弱的位點貢獻較大，而電化學氧化作用在場強較強的電極附近貢獻較大。研究結果有望為石油烴類污染物的微生物-電動修復過程調控提供一定的理論基礎。

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