馬鈴薯淀粉渣固態培養產朊假絲酵母的培養基優化研究

張靚 劉香瑩 權桂芝 童應凱 張怡

摘? 要：利用馬鈴薯廢渣為主要原料，固體培養產朊假絲酵母菌。通過單因素實驗確定其最優加水量為100%與接種量為10%，設計并實施了葡萄糖、硫酸銨、水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂五因素四水平的正交實驗，發酵后測定菌數，確定了最佳的培養基配方：葡萄糖9%、磷酸二氫鉀0.1%、水與物料1：1，在此配方下，接種量10%，30℃培養48h，菌量最高可達6.63億個/g。

關鍵詞：馬鈴薯;淀粉渣;固體發酵;產朊假絲酵母

中圖分類號：S532? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181233001

中國是馬鈴薯生產大國，生產總量位居世界第一。近年來，由于我國淀粉加工業的飛速發展，馬鈴薯廢渣作為副產物，產量巨大。如果不能及時合理地處理掉，就會造成資源的浪費和環境的污染，是世界各國相關生產企業和環境保護機構有待解決的重要問題。產朊假絲酵母（Candida utilis）是優良的生物飼料生產菌種，在飼料行業得到廣泛應用。本研究試圖以馬鈴薯淀粉廢渣為產朊假絲酵母培養料，進行固體發酵生產生物飼料，不僅能夠緩解蛋白原料短缺的現狀，還可以降低環境污染，變廢為寶。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?材料

1.1.1? ? ?菌種

產朊假絲酵母（Candida utilis）是天津農學院微生物實驗室保藏菌種。

1.1.2? ? ?培養基

種子液培養基。

YEPD培養基（g）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH6.0，115℃濕熱滅菌20min。

發酵培養基。

基本固體培養基（%）：馬鈴薯廢渣60%、麩皮40%，水，121℃，20min。

1.1.3? ? ?主要儀器

8037-SGS超型自動壓力蒸氣滅菌器，T-500型電子天平，mA200電子天平，100～1000?l和10～100?l的微量移液器，恒溫培養振蕩器，電熱恒溫培養箱，生物顯微鏡，血球計數板，漩渦震蕩器。

1.2? ? ?試驗方法

1.2.1? ? ?斜面活化

將實驗室冰箱中保藏的菌種接種在斜面培養基上活化，30℃，培養48h。

1.2.2? ? ?種子培養

從斜面適量菌種到裝量為60mL/250mL三角瓶中，30℃，180r/min，培養20h。

1.2.3? ? ?發酵培養

以1mL接種量接入與種子培養基相同的培養基中，裝入250mL三角瓶內，30℃，培養48h。

1.2.4? ? ?單因素試驗

為尋求產朊假絲酵母培養基中各組分對菌數影響的因素，從以下幾個方面進行試驗：從接種量與含水量確定固態發酵配方對菌數產生影響的最佳濃度，每個水平因素共有4個水平，每個水平有3個重復試驗（見表1）。

1.2.5? ? ?正交試驗

為了提高產朊假絲酵母的生長數量，培養基優化采用五因素四水平L16（45）正交試驗，共設有16個處理，每個處理有3個重復試驗。麩皮、馬鈴薯廢渣兩種簡單有機碳源發酵實驗。根 據單因素試驗的結果，選擇葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、水與固料的比值做正交試驗。用250mL三角瓶裝固料10g包括麩皮4g，馬鈴薯廢渣6g，水10mL，攪拌均勻，用微量移液器加人1mL的產朊假絲酵母菌液，在30℃恒溫箱中進行48h發酵，利用血球計數板法觀察并記錄，最后篩選出優化組合。（見表2）。

1.2.6? ? ?產朊假絲酵母固體發酵正交實驗設計（見表3）

按正交實驗表配以底料10g（馬鈴薯廢渣6g，麩皮4g）的培養基，加入不同比例的微量元素，并做3組重復。為使產朊假絲酵母菌能均勻分布到培養基中，可將產朊假絲酵母搖勻，然后向上述培養基中使用微量移液器加入1mL菌液。

接種好后把各組實驗放入30℃恒溫箱培養，48h后取出血球計數板法觀察記錄產朊假絲酵母菌數。觀察產朊假絲酵母數量方法如下：攪拌均勻，從三角瓶中取出1g樣品，加入由離心管裝的10mL無菌水中，使用漩渦震蕩器將樣品充分混勻后，使附著于固體樣品表面的菌均勻穩定分布在無菌水內。再吸取1mL混勻菌液，加入9mL無菌水內稀釋，加入100?l的美藍染色液，搖勻。將菌液放到血球計數板上，用40倍顯微鏡觀察，運用血球計數板（25×16）數菌數的方法，通過計算，便可得出菌種數量。

1.2.7? ? ?最佳配方重復

產朊假絲酵母菌的數量測定后，用極差分析出最佳結果，選出最佳培養基。重復最佳添加劑配方試驗，進行培養并測定菌數。

2? ? ?結果與分析

2.1? ? ?產朊假絲酵母發酵條件的單因素試驗

2.1.1? ? ?不同接種量對菌數的影響

據有關文獻報道，接種量對產朊假絲酵母菌數影響較大。選擇上述優化的培養基9%的葡萄糖為碳源，0.1%的磷酸二氫鉀（其余成分同發酵培養基），選擇接種量在4 %～12%之間，數據（3次重復實驗平均值）結果表明菌數隨著接種量的增加而增大，接種量從4%增加到16%時，菌數從2.25億個/g增加到4億個/g，提高了56.3%。當接種量為16%時，其菌數表現出最高水平，為4億個/g（見圖1）。但由于10%～16%的趨勢平緩，且成本增高的原因，通過進一步進行試驗，確定10%的接種量在實際生產中的性價比與產值最優，故最優接種量為10%。

2.1.2? ? ?不同含水量對菌數的影響

在測試含水量的影響時，為了減少不同水份的濕重/干重的誤差，均計算為干重下菌數。用固料與加水量1：1、1：1.3、1：1.6、1：1.9的比例來配培養基，使之達到不同的含水量，選擇上述優化的培養基9%的葡萄糖為碳源，0.1%的磷酸二氫鉀，其余成分同發酵培養基，數據（3次重復實驗平均值）結果表明在含水量80%～200%之間，含水量對菌數有一定的影響。在含水量120%時，菌數最高為3.51億個/g，在200%時，菌數最低為2.43億個/g，變化幅度為30.8%（見圖1）。因此，進一步試驗選擇含水量為100%。

2.1.3? ? ?單因素試驗小結

通過產朊假絲酵母培養的單因素試驗，得到菌種在葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0.1%，pH6.0（其余成分同發酵培養基）接種量12 %，固料底物與加水量比值為1：1，30℃在培養箱發酵48h的培養條件下，其菌數可達到4億個/g。

2.2? ? ?正交試驗結果及極差分析

根據L16（45）正交試驗表，每一個處理均有3個重復試驗，結果及極差分析見表3。

2.3? ? ?正交試驗小結

從表3的分析中可知，葡萄糖（碳源）為主要的影響因素，葡萄糖濃度的變化對產朊假絲酵母菌數影響最大，最適的葡萄糖濃度為9%;磷酸二氫鉀濃度的變化對產朊假絲酵母菌數的影響次于葡萄糖的作用，以0.1%磷酸二氫鉀濃度最好;硫酸銨及硫酸鎂濃度的變化對產朊假絲酵母菌數的影響不是很大。可能原因是麩皮和馬鈴薯廢渣中本身就含有這兩種微量元素。而磷酸二氫鉀與葡萄糖則需補充。

3? ? ?結論

單因素實驗測定出產朊假絲酵母發酵最佳培養條件的加水量是100%，接種量是12%。通過正交試驗的優化組合，得到產朊假絲酵母菌數的最優培養條件是：葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0.1%，水與固料比值為1：1，初始pH值6.0，接種量12%，加入10mL蒸餾水，以10g馬鈴薯廢渣與麩皮混合的培養基為固體底料，加入1mL產朊假絲酵母菌液，發酵溫度為30℃，培養48h，在此優化的培養條件下，產朊假絲酵母的菌數可達6.63億個/g。通過接種酵母菌進行固體發酵，轉化為生物飼料，可以有助于解決馬鈴薯淀粉廢渣的污染問題，變廢為寶。

參考文獻

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