不同菌種對(duì)黃金芽綠茶γ-氨基丁酸含量和茶葉品質(zhì)的影響

彭葉,李美鳳,韋圻,楊云,黃濤,王紹英,劉建軍

(貴州大學(xué) 茶學(xué)院,貴州 貴陽,550025)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA),是一類非蛋白質(zhì)氨基酸[1],作為一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2],被用來減輕癲癇[3]、改善運(yùn)動(dòng)能力[4]和抑制哮喘[5]等,提高茶葉中GABA含量及其品質(zhì),對(duì)人類健康有著重要意義。黃金芽是一個(gè)黃色系變異的白化稀有品種,被大面積推廣種植,其氨基酸含量是普通茶樹品種的2～3倍,其中谷氨酸是合成GABA的前體物質(zhì)[6],為合成GABA提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。

張金玉等[7]運(yùn)用同種加工工藝處理福鼎大白茶、黃金芽和白葉1號(hào),結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃金芽的GABA含量最高。DAI等[8]研究表明,厭氧處理使茶葉GABA含量增加了16倍;WU等[9]研究了GABA分流和多胺(polyamine,PA)降解途徑對(duì)新鮮茶葉GABA積累的影響,發(fā)現(xiàn)厭氧能積累GABA,好氧處理GABA積累減少,再次厭氧,GABA的積累又有所提升。邵文韻[10]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸溶液處理茶葉的效果略好于谷氨酸鈉溶液,噴灑處理的效果好于浸泡處理。目前,可通過厭氧和外源噴施谷氨酸鈉等方法富集GABA[11],且這方面的研究已經(jīng)取得十分可觀的進(jìn)展,但厭氧處理和噴施谷氨酸鈉等方法均會(huì)使成品茶產(chǎn)生不愉悅氣味,導(dǎo)致大眾接受度不高,影響其市場(chǎng)推廣。

利用具備高安全性可食用微生物生產(chǎn)GABA的研究有很多,如酵母菌[12]和短乳桿菌[13]等,但將微生物運(yùn)用到茶葉生產(chǎn)中的很少,尤其是運(yùn)用到綠茶加工工藝中的更是鮮有報(bào)道。本研究以高氨基酸含量的黃金芽為原料,以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、酵母菌YA200和釀酒酵母共5種可食用菌為試驗(yàn)菌種,結(jié)合綠茶加工工藝,通過感官審評(píng)和理化分析,探求不同菌種對(duì)黃金芽GABA的富集效果和對(duì)茶葉品質(zhì)的影響,為生產(chǎn)高品質(zhì)高GABA黃金芽綠茶提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

黃金芽一芽二、三葉,10月份采摘自貴州省甕安鑫產(chǎn)園茶葉有限公司茶園。

1.1.2 主要試劑

GABA、茶氨酸(Thea)、谷氨酸(Glu)等19種氨基酸標(biāo)品(純度≥98%),成都克洛瑪生物科技有限公司;保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、釀酒酵母凍干粉,貴州慕為美科技有限公司;YA200酵母菌,安琪酵母股份有限公司;兒茶素(catechinic acid,C)、表兒茶素(epicatechin,EC)、沒食子兒茶素(epigallocatechin,GC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate,CG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和咖啡堿(caffeine,CAF)標(biāo)品(純度≥98%)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)、NaHCO3、KH2PO4、NaAc、HAc(分析純,純度≥99.5%)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、乙腈、甲醇(HPLC級(jí)),北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6CSF-110超高溫?zé)犸L(fēng)茶葉滾筒殺青機(jī)、6CR-65全自動(dòng)茶葉揉捻機(jī),浙江上洋機(jī)械股份有限公司;6CFJ-8B紅茶發(fā)酵機(jī),貴州雙木農(nóng)機(jī)有限公司;WGL-45B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,天津泰斯特儀器有限公司;UItiMate 3000高效液相色譜儀、X1R通用臺(tái)式離心機(jī),ThermoFisher Scientific。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同菌種處理茶樣制備

工藝流程:鮮葉→殺青→揉捻→接菌→干燥;具體操作如下:黃金芽鮮葉統(tǒng)一經(jīng)350 ℃滾筒殺青,按輕-重-輕先后揉捻,共揉捻40 min。稱取揉捻葉每份 500 g 共6份。參考李亞莉等[14]的方法,結(jié)合實(shí)際情況,分別配制濃度為10%的不同菌液100 mL,將100 mL純凈水(CK)和不同菌液分別噴施在揉捻葉上,保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌放在37 ℃發(fā)酵箱,酵母菌YA200和釀酒酵母室溫放置,均放置4 h,于干燥箱80 ℃烘2 h,制成干茶。純凈水、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、酵母菌YA200、釀酒酵母處理的樣品,其編號(hào)分別用CK、1、2、3、4、5表示。

1.3.2 感官審評(píng)

依照GB/23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的綠茶審評(píng)方法,結(jié)合DB32/T 3210—2017《黃金芽茶質(zhì)量分級(jí)》中的黃金芽審評(píng)方法,由5位審評(píng)專家對(duì)樣品的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進(jìn)行密碼審評(píng)。計(jì)分時(shí)按外形15%、湯色10%、香氣30%、滋味35%、葉底10%的權(quán)重進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)算。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 GABA含量測(cè)定

參考邵文韻[10]的方法,略做改動(dòng)。樣品測(cè)定:茶樣磨碎,過100目篩,稱取各茶樣3份,每份0.3 g(感量0.000 1 g)于100 mL離心管中,加50 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,放入70 ℃水浴鍋浸提30 min(隔10 min搖動(dòng)1次),取出冷卻至室溫,分別吸取上清液1 mL放入2 mL離心管內(nèi),于12 000 r/min,4 ℃條件下離心10 min。離心后各取200 μL上清液加入20 μL 10 g/L的DNFB,100 μL 0.5 mol/L NaHCO3(pH 9.0)和180 μL超純水,密封混勻,于60 ℃水浴鍋暗反應(yīng)1 h后冷卻至室溫,加入400 μL 0.01 mol/L KH2PO4(pH 7.0),搖勻后放置15 min,離心,過0.22 μm濾頭,待測(cè)。

建立標(biāo)曲:配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取5、10、20、40、80、160 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 mL離心管中,定容至1 mL混勻。取200 μL加入20 μL 10 g/L的FDBN,100 μL 0.5 mol/L NaHCO3(pH 9.0)和180 μL超純水,密封混勻,于60 ℃水浴鍋暗反應(yīng)1 h后冷卻至室溫,加入400 μL 0.01 mol/L KH2PO4(pH 7.0),搖勻放置15 min,過0.22 μm濾頭,待測(cè)。

色譜條件:A:稱取0.680 4 g NaAc,加入50 mL THF,定容至1 L;B:甲醇。色譜柱:HITACHI LACHROM C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長:360 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;梯度洗脫程序如表1所示。

表1 GABA 測(cè)定梯度洗脫程序

1.3.3.2 主要品質(zhì)成分測(cè)定

兒茶素組分和CAF檢測(cè)參考楊金川等[15]方法,略做改動(dòng);樣品制備:準(zhǔn)確稱取0.200 0 g過100目篩的茶粉于15 mL離心管,加10 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇,70 ℃水浴鍋提取10 min(每5 min搖1次),4 ℃,8 000 r/min離心5 min,將上清液移到25 mL容量瓶。殘?jiān)? mL 70%甲醇重復(fù)提取1次,合并上清液,并用穩(wěn)定溶液(25 mL 10 g/L EDTA+25 mL 10 g/L維生素C+50 mL甲醇+400 mL超純水)定容,搖勻,過0.22 μm濾頭,待測(cè)。

色譜條件:色譜柱:HITACHI LACHROM C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測(cè)波長:275 nm,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,梯度洗脫程序如表2。

表2 兒茶素組分和咖啡堿測(cè)定梯度洗脫程序

氨基酸組分測(cè)定參考葉玉龍[16]的測(cè)定方法,略作改動(dòng);茶湯制備稱取0.300 0 g過100目篩茶粉于50 mL離心管中,加沸蒸餾水45 mL,立即轉(zhuǎn)入沸水浴浸提45 min(每10 min搖1次),8 000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶,冷卻后用水定容,搖勻。吸取40 μL茶湯、200 μL 1% DNFB、200 μL NaHCO3(0.5 mol/L,pH 9.0)和360 μL超純水于2 mL 離心管中混勻,60 ℃暗水浴60 min,冷卻至室溫后加入800 μL KH2PO4(0.01 mol/L,pH 7.0),窩旋1 min,暗條件放置15 min,過0.22 μm濾頭,待測(cè)。

色譜條件:流動(dòng)相A:色譜柱:Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測(cè)波長:360 nm,流速0.9 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,梯度洗脫程序如表3。流動(dòng)相:A:V[NaAc(4 mmol/L,pH 5.5)]∶V(THF)=96∶4;B:V(乙腈)∶V(水)=80∶20;梯度程序如表3所示。

表3 氨基酸測(cè)定梯度洗脫程序

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS對(duì)接菌樣和CK樣的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,運(yùn)用TBtools、SIMCA和Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種對(duì)黃金芽綠茶感官品質(zhì)影響

感官審評(píng)結(jié)果如圖1所示,不同菌種處理對(duì)茶樣的外形沒有顯著影響,對(duì)湯色影響較大。具體見表4。菌種處理的茶樣中,1和4處理茶樣湯色黃綠較明亮,5湯色黃綠尚明亮,評(píng)分較低,在90.17～90.33分;2和3湯色綠黃明亮,和CK沒有顯著差別,評(píng)分較高,在90.67～91.83分。

圖1 不同菌種處理茶樣感官審評(píng)圖片

表4 不同菌種處理茶樣感官審評(píng)結(jié)果

CK樣香氣清香,接菌樣香氣純正帶菌香,4和5香氣和滋味都帶特殊菌味,顯著優(yōu)于其他茶樣;其中4的菌香持久,香氣得分為92.83±0.29,顯著高于其他茶樣,滋味鮮爽,略帶菌味,得分為92.33±0.58,略高于CK和5,顯著高于1、2和3,表明酵母菌YA200對(duì)茶樣的香氣和滋味影響最大。所有茶樣葉底金黃明亮,較勻齊,外觀差別不大。茶樣感官審評(píng)綜合評(píng)分結(jié)果為:4(90.71)>CK(90.13)>5(89.95)>3(89.63)>2(89.36)>1(89.35)。綜上,酵母菌YA200處理的茶樣香氣、滋味和感官審評(píng)綜合評(píng)分最高,所有茶樣中整體表現(xiàn)最好。

2.2 不同菌種對(duì)黃金芽綠茶GABA含量影響

不同菌種對(duì)黃金芽綠茶GABA的含量影響如圖2所示,與CK相比,接菌均能顯著提高黃金芽中的GABA含量。1、2和3的GABA含量顯著低于4和5。所有茶樣中CK的GABA含量最低,為(0.228±0.02)mg/g,接菌樣中,1的GABA含量最低,為(0.396±0.01) mg/g,4的GABA含量為(1.478±0.047) mg/g,顯著高于其他茶樣,是CK的6.48倍,1的3.73倍,2的2.44倍,3的2.14倍,5的1.48倍;5的GABA含量為(0.999±0.06) mg/g,僅次于4。

圖2 不同菌種處理茶樣GABA含量

2.3 不同菌種對(duì)黃金芽綠茶兒茶素組分和咖啡堿含量影響

不同菌種對(duì)黃金芽兒茶素組分影響如表5所示,接菌茶樣兒茶素總量顯著高于CK,EGCG在兒茶素組分中含量最高,在所有茶樣中,EGCG占兒茶素總量的42.12%～47.20%。C、EC、EGC和GC屬于簡單兒茶素,EGCG、CG、GCG和ECG屬于酯型兒茶素[17]。與CK相比,接菌樣品的簡單兒茶素均呈增加趨勢(shì),增幅為34.38%～45.45%;其中,1的簡單兒茶素的含量最高;不同菌種對(duì)茶樣酯型兒茶素的影響不同,2增加了4.72%,3增加了0.24%,1、4和5的酯型兒茶素則呈下降趨勢(shì),分別降低了1.56%、9.33%和10.00%。不同菌種處理均顯著降低茶樣CAF含量,4和 5的CAF分別下降了18.55%和24.38%。

表5 不同菌種處理茶樣兒茶素組分和咖啡堿含量

如圖3所示,4和5的兒茶素組分和CAF聚為一類,CK單獨(dú)為一類,1、2和3聚為一類。表明不同菌種對(duì)茶樣的兒茶素組分和CAF含量影響顯著,其中4與 5的影響相似,1、2和3的影響相似。

圖3 不同菌種處理茶樣兒茶素組分和咖啡堿聚類熱圖

2.4 不同菌種對(duì)黃金芽綠茶氨基酸組分影響

茶葉中常見的氨基酸有20多種,其中脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)屬于甜味氨基酸;苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)屬于苦味氨基酸;天冬氨酸(Asp)、茶氨酸(Thea)和谷氨酸(Glu)屬于鮮味氨基酸[18];不同菌種對(duì)黃金芽氨基酸組分影響如表6所示,接菌會(huì)顯著降低黃金芽的氨基酸總量,1、2和3的降幅尤為明顯,4的氨基酸總量雖然降低了4.91%,但降幅最小;此外,4的Asp、His和Gly等呈味氨基酸含量顯著高于其他茶樣。不同菌種處理均使茶樣的甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸有不同程度的降低,接菌茶樣的甜味氨基酸下降了10.83%～35.46%,苦味氨基酸下降了9.89%～22.57%,鮮味氨基酸下降了3.57%～30.49%。

表6 不同菌種處理茶樣氨基酸組分含量

不同菌種對(duì)黃金芽綠茶氨基酸組分影響各異,如圖4所示,2的氨基酸組分單獨(dú)為一類,1和3聚為一類,4和5則與CK聚為一類。表明保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌對(duì)茶樣的氨基酸組分影響顯著,其中保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌對(duì)茶葉的氨基酸組分影響相似,酵母菌YA200和釀酒酵母對(duì)茶葉的氨基酸組分影響不顯著。

圖4 不同菌種處理茶樣氨基酸組分聚類熱圖

2.5 不同菌種處理黃金芽綠茶特征性成分分析

利用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)對(duì)CK和接菌樣的兒茶素組分、CAF和氨基酸組分進(jìn)行可視化處理,PCA得分如圖5-A所示,接菌樣與CK分布區(qū)域明顯不同,證明不同菌種處理對(duì)茶樣的兒茶素組分、CAF和氨基酸組分影響顯著。保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌對(duì)黃金芽的兒茶素組分、CAF和氨基酸組分影響效果接近,酵母菌YA200和釀酒酵母對(duì)黃金芽的兒茶素組分、CAF和氨基酸組分影響效果接近。

A-PCA得分圖;B-OPLS-DA得分圖;C-OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖;D-OPLS-DA VIP值圖

在PCA的基礎(chǔ)上,對(duì)不同菌種處理茶樣的兒茶素組分、CAF和氨基酸組分進(jìn)行OPLS-DA分析,由圖5-B可知,OPLS-DA模型中所有茶樣都在95%置信區(qū)間內(nèi),證明模型穩(wěn)定可靠。設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列200次做置換檢驗(yàn)(圖5-C),R2擬合直線在Y坐標(biāo)軸上的截距為0.226,小于0.3,Q2擬合直線在Y坐標(biāo)軸上的截距為-0.838,小于0,證明OPLS-DA模型不存在過度擬合現(xiàn)象,穩(wěn)定可靠。

由OPLS-DA模型中的變量權(quán)重值(variable importance in projection,VIP)(圖5-D)可知,共有10種成分的VIP值大于1,包括8種氨基酸組分和2種兒茶素組分,分別為:Thr(VIP=1.20)、Gly(VIP=1.17)、His(VIP=1.16)、Arg(VIP=1.14)、Ala(VIP=1.09)、Leu(VIP=1.04)、Cys(VIP=1.04)、GABA(VIP=1.03)、GCG(VIP=1.19)、EGCG(VIP=1.00)。結(jié)合表3和表4,發(fā)現(xiàn)Thr、GABA、Ala是CK與接菌樣的差異代謝產(chǎn)物,GABA在接菌樣中的含量顯著高于CK樣,是接菌樣與CK樣的標(biāo)志性成分。

3 結(jié)論與討論

微生物被用于發(fā)酵食品、提高食物的GABA含量和GABA的工業(yè)生產(chǎn)中[19-20],為探明微生物是否能提高茶葉的GABA含量和品質(zhì),本研究分別用濃度為100 g/L的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、酵母菌YA200和釀酒酵母處理黃金芽揉捻葉4 h,檢測(cè)烘干樣發(fā)現(xiàn),5種菌都能顯著提高黃金芽的GABA含量,趨勢(shì)與RAMOS等[19]和ASUN等[20]的研究一致。許多微生物能產(chǎn)GABA是因?yàn)槲⑸锉旧砀缓劝彼崦擊让竅21-22],4的GABA含量最高可能是因?yàn)榻湍妇鶼A200的谷氨酸脫羧酶含量或活性比其他菌種高,但微生物能提高茶葉GABA含量的真正原因還有待下一步的深入研究。

酯型兒茶素和CAF是茶湯滋味苦澀的主要影響因素,歐惠算[23]研究發(fā)現(xiàn),對(duì)六堡茶的茶湯進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)某些微生物可降低酯型兒茶素含量,而簡單兒茶素隨發(fā)酵時(shí)間呈先增加后降低趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn),1、4和5的酯型兒茶素含量顯著降低,趨勢(shì)與歐惠算的研究結(jié)果一致;2和3的酯型兒茶素含量有所增加,可能是因?yàn)槭葻徭溓蚓椭参锶闂U菌的特性與其他菌不一樣。接菌處理4 h均導(dǎo)致黃金芽中的簡單兒茶素含量有不同程度增加,與歐惠算的發(fā)酵前期趨勢(shì)一致,接菌樣品簡單兒茶素含量高可能是因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵過程中菌株分泌的水解酶和氧化酶將酯型兒茶素分解為簡單兒茶素。許多研究表明,微生物可降解CAF[24-25],本研究發(fā)現(xiàn),與CK相比,接菌茶樣的CAF含量顯著降低,與前人研究結(jié)果一致。簡單兒茶素的增加和CAF降低會(huì)使接菌樣的茶湯苦澀程度大大降低,該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)茶樣感官審評(píng)中接菌樣茶湯滋味均無苦澀味一致。

氨基酸是茶湯鮮味、甜味的重要組成部分,接菌處理不僅顯著降低了茶樣的總氨基酸含量,還使茶樣的甜味、苦味和鮮味氨基酸有不同程度的降低;前人研究發(fā)現(xiàn),氨基酸是微生物發(fā)酵過程中的主要可同化含氮物[26],這可能是接菌樣氨基酸總量以及甜味、鮮味和苦味氨基酸含量比CK低的原因。接菌樣氨基酸組分及總量的降低會(huì)使接菌樣鮮爽味不足,該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)茶樣感官審評(píng)中除酵母菌YA200處理的茶樣外,其他菌種處理的茶樣茶湯滋味鮮爽味均低于CK一致。

基于菌種本身的特性,接菌樣的干茶外形、湯色和葉底的色澤均受到一定的負(fù)面影響;但接菌茶樣不僅有綠茶特有的清香,還有菌自帶的菌香;由于酯型兒茶素和CAF含量降低,在減輕茶湯的滋味苦澀味的同時(shí)賦予了茶湯特有的菌味。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,接菌能顯著提高黃金芽綠茶的GABA和簡單兒茶素含量,降低CAF和總氨基酸含量,接菌茶樣香氣純正,菌香持久,滋味鮮醇帶菌味;酵母菌YA200處理的茶樣GABA含量顯著最高,香氣和滋味顯著最好,感官審評(píng)綜合評(píng)分最高,可作為黃金芽綠茶加工過程中提高功能成分GABA和提升茶葉品質(zhì)的最佳菌種。