金蕎麥藥酒對膠原誘導關節炎大鼠凋亡基因及基質蛋白酶的影響

潘朝旺 王 偉 萬進軍

(鄂州職業大學醫學院藥學系，湖北 鄂州 436000)

王慶等〔1〕研究表明老年風濕性關節炎患者自我管理行為與自我效能有明顯相關性，但藥物治療具有更重要的地位。金蕎麥具有清熱解毒，潤肺補腎，健脾止瀉，祛風濕之功效。本實驗研究金蕎麥藥酒對Ⅱ型膠原誘導關節炎(CIA)模型大鼠血清基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、滑膜細胞相關凋亡基因caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達、脾臟淋巴細胞凋亡率及膝關節滑膜巨噬細胞密度的影響。

1 材料與方法

1.1動物 18月齡雌性SD大鼠80只，體重(390±30)g，SPF級，由三峽大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(鄂)2011-0012。

1.2藥品與試劑 本實驗所用金蕎麥2014年3月購于湖北省鄂州市中醫院，經鄂州市藥品檢驗所鄭本瑞主任藥師鑒定為蓼科植物金蕎麥Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara的干燥根莖，符合《中華人民共和國藥典》2010年版標準。金蕎麥藥酒，淡黃色液體，本院自制，將金蕎麥飲片與白酒以4∶11(g∶ml)比例常溫浸泡60 d，倒出液體，用白酒調節至每毫升藥酒相當于金蕎麥原藥材0.4 g，本實驗劑量以原生藥表示，臨用前用生理鹽水稀釋成不同濃度；雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司生產，批號：20131114；完全弗氏佐劑(FCA)、雞Ⅱ型膠原(CⅡ)，Sigma 公司；Trizol試劑，RNA逆轉錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；大鼠血清MMP-2、MMP-9酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒，卡邁舒(上海)生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，天津百浩生物科技有限公司；ED1單抗(標記巨噬細胞)，上海今邁生物科技有限公司；SP免疫組織化學檢測試劑盒，上海研卉生物科技有限公司；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器 9602A酶標儀，南京普朗醫用設備有限公司；超聲波細胞粉碎機，上海豫明儀器有限公司；臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器公司；Z160M微量高速離心機，德國HERMLE；CFX 96 Touch PCR儀，美國伯樂；PT-MR3100D組織勻漿機，瑞士Polytron公司；UV754紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；病理切片機HS2046，金華市華速科技有限公司；OLYPUS BX-60光學顯微鏡，日本；PV-200 型足容積測定儀，成都泰盟科技有限公司。

1.4動物造模及分組給藥 隨機抽取大鼠10只，為正常組，其余50只建立CIA模型〔2,3〕，將CⅡ溶于0.2%醋酸，濃度為2 mg/ml，4℃條件下放置過夜，與等體積FCA混合，于冰浴中充分乳化，即得CⅡ乳劑，于每只大鼠尾根部、背部、右后肢足趾3點皮內共注射0.4 ml，正常組于相同部位3點注射生理鹽水0.1 ml。7 d后所有造模大鼠按原方法注射CⅡ乳劑0.2 ml加強免疫1次。將造模大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、高劑量金蕎麥組、中劑量金蕎麥組、低劑量金蕎麥組。正常組、模型組于造模后每天灌胃生理鹽水15 ml/kg，陽性對照組每天灌胃雷公藤多苷混懸液0.03 g/kg，高、中、低劑量金蕎麥組分別每天灌胃不同濃度金蕎麥藥酒2.16、1.08、0.54 g/kg，灌胃體積為10 ml/kg，連續給藥21 d。

1.5觀察指標及方法 觀察記錄致炎后第12、15、18、21天各組大鼠左后足跖腫脹體積。末次給藥2 h后，常規對各組大鼠眶靜脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液于-70℃保存待用。ELISA測定血清MMP-2、MMP-9水平。

1.6RT-PCR檢測滑膜細胞凋亡相關基因caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達 取大鼠后肢右膝關節，分離出滑膜，常規Trizol法提取滑膜細胞總RNA，檢查純度和濃度達到要求后，按照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA。根據上海捷瑞生物工程有限公司提供的caspase-3、caspase-9、β-actin核苷酸序列設計和合成引物，按SYBR Premix Ex Taq 試劑盒說明添加PCR反應體系，進行caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA的cDNA擴增，反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火60 s，40個循環結束。RT-PCR數據處理采用2-ΔΔCt法。

1.7流式細胞術檢測脾臟淋巴細胞凋亡 取大鼠脾臟，稱重后剝離干凈，生理鹽水沖洗，取加磷酸鹽緩沖液研磨，過100目篩，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，向沉淀中加適量紅細胞裂解液，混勻后靜置5～6 min，再1 000 r/min離心10 min，用1640完全培養液(加入10%胎牛血清)重懸細胞，調整細胞濃度2×106個/ml，取上述液體0.1 ml按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測分析。

1.8膝關節滑膜ED1免疫組化染色及巨噬細胞計數 取大鼠后肢左膝關節，分離膝關節皮膚、肌肉等組織，暴露膝關節，固定，用手術剪沿髕骨周圍將整塊滑膜剪成條狀，立即用10%甲醛液固定，石蠟包埋切片，SP染色法進行ED1免疫組化染色(ED1單抗濃度為1∶20)，AEC顯色，顯微鏡下觀察滑膜襯里層ED1陽性細胞分布密度(細胞數/mm2)。

1.9統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組足跖腫脹體積比較 與正常組比較，模型組自第12天起有明顯腫脹(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和金蕎麥各劑量組腫脹體積下降，自第15天起基本上差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2各組血清MMP-2、MMP-9水平比較 與正常組比較，模型組MMP-2、MMP-9水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組MMP-2、MMP-9明顯下調(P<0.05，P<0.01)，低劑量金蕎麥組MMP-9也明顯下調(P<0.05)。見表2。

2.3各組滑膜細胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比較 與正常組比較，模型組caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥量組caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達明顯上調(P<0.01)，低劑量金蕎麥組caspase-9 mRNA表達也明顯上調(P<0.05)。見表2。

表1 各組足跖腫脹體積比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 各組血清MMP-2、MMP-9水平及滑膜細胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比較

2.4各組脾臟淋巴細胞凋亡水平比較 與正常組比較，模型組脾淋巴細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組脾淋巴細胞凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01)，低劑量金蕎麥組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.5各組膝關節滑膜巨噬細胞水平比較 與正常組比較，模型組巨噬細胞密度明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組巨噬細胞密度明顯降低(P<0.05,P<0.01)，低劑量金蕎麥組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組脾臟淋巴細胞凋亡、膝關節滑膜巨噬細胞水平比較

3 討 論

MMPs可降解軟骨和關節骨中的蛋白多糖、膠原等細胞外基質大分子，從而促進血管翳對軟骨的侵襲，引起韌帶、軟骨、骨的破壞〔4，5〕。MMP-2和MMP-9作為明膠酶類基質金屬蛋白酶，兩者作用底物近似，對間質膠原、明膠、彈性蛋白、和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型膠原等細胞外基質成分有降解作用〔6，7〕。在所有MMPs中，MMP-2表達最廣泛，對結締組織的生理代謝具有重要意義，過度表達可導致關節炎的發生，應用MMPs抑制劑可以阻止關節的破壞已經在動物實驗中得到證實〔8〕。本實驗表明，金蕎麥藥酒可降低CIA大鼠血清MMP-2和MMP-9水平，從而抑制軟骨和關節骨中細胞外基質降解。線粒體途徑是細胞凋亡的經典途徑之一，在凋亡刺激因子作用下，細胞色素C釋放，與凋亡蛋白激活因子結合，形成多聚復合物，導致caspase-9活化，后者再活化下游的caspase-3，引發級聯反應，分解大量的細胞底物，最終導致細胞凋亡〔9〕。升高caspase-3水平可以促進RA大鼠增生的滑膜細胞凋亡。本實驗表明，金蕎麥藥酒可增強CIA大鼠滑膜細胞caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達，促進增殖的滑膜細胞凋亡，改善風濕性關節炎的病理狀態。在風濕性關節炎患者病變關節滑膜內，巨噬細胞數量明顯增多，其不僅與關節疼痛數、壓痛數、紅細胞沉降率、C 反應蛋白等反映風濕性關節炎病情程度的指標呈明顯正相關，還與X線關節破壞的侵蝕積分和狹窄積分呈明顯的正相關，可能與其釋放腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6等炎性因子有關。本實驗同時顯示，風濕性關節炎大鼠脾淋巴細胞凋亡率較正常大鼠明顯降低，其機制有待進一步研究。

1王 慶，徐桂華，錢 先，等.老年類風濕關節炎患者自我管理行為與自我效能的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(16):4684-5.

2徐 琦，尹抗抗，譚達全，等.麻黃加術湯對大鼠類風濕性關節炎模型作用機制的研究〔J〕.湖南中醫藥大學學報，2011;31(5):13-5.

3馬艷苗，王永輝，李艷彥，等.風濕寧膠囊對膠原誘導性關節炎大鼠滑膜細胞超微結構及細胞凋亡相關基因表達的影響〔J〕.中醫雜志，2013;54(4):326-8，335.

4許 蕾，解思濤，譚 磊,等.中西醫治療類風濕關節炎的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(5):1436-7.

5馬 玲.糖皮質激素在調節類風濕關節炎患者多項血清因子中的效果觀察〔J〕.醫學理論與實踐,2015;28(11):1423-5.

6Kim KS，Choi HM，Lee YA，etal.Expression levels and association of gelatinases MMP-2 and MMP-9 and collagenases MMP-1 and MMP-13 with VEGF in synovial fluid of patients with arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2011;31(4):543-7.

7Nyman JS，Lynch CC，Perrien DS，etal.Differential effects between the loss of MMP-2 and MMP-9 on structural and tissue level properties of bone〔J〕.J Bone Miner Res，2011;26(6):1252-60.

8Ishikaw T，Nishigakia F，Miyata S，etal.Prevention of progressive joint destruction in adjuvant induced arthritis in rats by a novel matrix metalloproteinase inhibitor，FR217840〔J〕.Eur J Pharmacol，2005;(508):239-47.

9林昌松，陳秀敏，林 云.昆母湯醇提液對人類風濕 關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡及caspase-3表達的影響〔J〕.廣東醫學，2015;36(3)：339-41.