下調雄激素受體表達對不同類型老年宮頸癌患者癌細胞活性的影響

楊 文 馮 文

(徐州醫科大學附屬連云港醫院 連云港市第一人民醫院婦產科，江蘇 連云港 222000)

宮頸癌多發于絕經后的老年女性，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)長期感染是宮頸癌發生的必要因素〔1〕。相關研究顯示，高危型HPV誘發宮頸癌上皮細胞惡性轉變中雄激素可能發揮協同、促進作用〔2〕，而G蛋白耦聯受體(Cpr)30可參與介導雄激素的快速基因組轉錄反應，其作用機制可能與Cpr30/Tlr3信號通路有關〔3〕。雌激素在宮頸癌發病機制中的作用已得到證實，但其中非激素依賴性的發生無法通過雌激素/雌激素受體通路加以解釋〔4〕。相關研究顯示，前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，雄激素受體(AR)高表達與病情進展有明顯關聯〔5〕。本研究選取C33a細胞為宮頸腺癌體外模型，Caski細胞為Ⅱ型宮頸鱗癌體外模型，以AR為靶點構建小干擾RNA(siRNA)，慢病毒為載體轉染細胞株，檢測細胞凋亡情況，并探討其可能作用機制。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 人宮頸腺癌細胞系C33a、宮頸鱗癌細胞系Caski均購于上海素爾生物科技有限公司，主要試劑：DMEM細胞培養基、胰蛋白酶、Trizol試劑盒購于無錫市賽爾百靈生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于北京瑞爾欣德科技有限公司；AR抗體、帶熒光蛋白的慢病毒AR siRNA載體購于杭州華安生物技術有限公司。

1.2細胞培養與轉染 C33a、Caski細胞分布置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及鏈霉素的DMEM培養基中，放入37℃ 5%CO2濃度的培養箱中孵育。用慢病毒AR siRNA載體轉染上述細胞株進行預實驗，選取最佳培養條件和感染復數(MOI)值，轉染72 h后熒光顯微鏡下評定轉染效率，熒光率>80%者可進行正式實驗，分為3組：AR干擾組(轉染AR基因慢病毒干擾載體)，陰性對照組(轉染AR基因陰性慢病毒載體)，空白對照組(僅加入正常培養基)。轉染后均按原培養方案繼續培養，每組均分為兩份，分別用于RNA、蛋白提取。

1.3熒光定量PCR檢測AR mRNA表達情況 Trizol試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度和純度，逆轉錄得到cDNA，使用SYBR GreenⅠMaster試劑進行熒光定量PCR檢測，引物序列如下：AR上游：5′-TGGCRCRCRAACAACAAC-3′，下游：5′-GTAGGTGTGCGAGACGTC-3′；三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游：5′-CGTGGCAGTTCCGACTCT-3′，下游：5′-ACCACT TCGCGGT CAGCC-3′。反應條件：95℃ 5 s，95℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，共40個循環。在每次延伸階段測吸光度值，雙標準曲線法得出目的基因相對表達量。

1.4Western印跡檢測AR蛋白表達情況 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，取上清測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人AR抗體(1∶500)，鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內參，4℃培養過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，培養4 h，電化學發光法(ECL)顯色，避光環境下顯影、定影，分析各條帶灰度值。

1.5細胞凋亡情況檢測 Annexin染色法檢測各組細胞凋亡情況，收集AR干擾組和陰性對照組細胞，磷酸緩沖液洗滌后，加緩沖液制成密度為1×105的細胞懸液；向流式細胞儀上樣管中加入100 μl細胞懸液，滴加染料混合均勻，室溫下暗室中靜置30 min，分別滴加500 μl緩沖液，60 min內使用流式細胞儀進行檢測。

1.6Cpr30 mRNA和蛋白表達情況檢查 RT-PCR檢測Cpr30 mRNA表達情況：提取3組細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，進行PCR擴增。反應體系30 μl。擴增條件同1.3，共40個循環；取擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統分析條帶灰度值，計算相對表達量。Western印跡檢測Cpr30蛋白表達情況：蛋白裂解液提取3組細胞總蛋白，行10% SDS-PAGE電泳，蛋白質濕法轉移，免疫檢測，電化學顯影，軟件分析各條帶灰度值。

1.7統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組AR mRNA及其蛋白表達情況 AR干擾組C33a、Caski AR mRNA及其蛋白的相對表達量較陰性對照組、空白對照組明顯降低(P<0.05)；陰性對照組與空白對照組C33a、Caski AR mRNA及其蛋白的相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組宮頸癌細胞AR mRNA及其蛋白相對表達量

與AR干擾組比較：1)P<0.05

1為空白對照組；2 為AR干擾組；3為陰性對照組；下圖同圖1 各組宮頸癌細胞AR蛋白表達水平

2.2下調AR表達對各組宮頸癌細胞凋亡的影響 AR干擾組C33a、Caski凋亡率較陰性對照組和空白對照組明顯增加(P<0.05)；而陰性對照組與空白對照組C33a、Caski凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。AR干擾組內比較顯示，C33a凋亡率明顯大于Caski凋亡率(P<0.05)。見表2。

表2 各組宮頸癌細胞凋亡情況

與AR干擾組比較:1)P<0.05；與同組Caski細胞比較：2)P<0.05

2.3各組細胞中Cpr30 mRNA及其蛋白表達情況 AR干擾組Cpr30 mRNA及其蛋白相對表達量均明顯高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；而陰性對照組與空白對照組Cpr30 mRNA及其蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 各組細胞中Cpr30 mRNA及其蛋白相對表達量

與AR干擾組比較：1)P<0.05

圖2 各組C33a細胞、Caski細胞中Cpr30 mRNA表達情況

3 討 論

宮頸癌的發生與發展是一個多因素調控的復雜過程，涉及抑癌基因、促癌基因、轉錄信號等多種信號通路途徑〔6〕。在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤中AR基因的高表達與病情進展和預后存在明顯關聯，AR基因已受到腫瘤基礎研究領域的廣泛關注，有望成為生殖道惡性腫瘤治療的新靶點。Cpr30與相應配體相互結合后可有效活化表皮生長因子受體(EGFR)、細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號激酶，提升環磷酸腺苷(cAMP)、鈣離子濃度，激活相應的信號傳導通路，使雌激素敏感器官出現增殖反應〔7〕。Cpr30水平提升與卵巢癌、乳腺癌的發生發展有明顯關聯〔8〕。而AR表達改變對Cpr30水平的影響目前仍未見系統研究報道。本研究結果提示下調AR表達可提升Cpr30表達水平，進而激活Cpr30/Tlr3信號通路，促進宮頸癌細胞凋亡。

1Hariri-Tabrizi S，Aghamiri SM，Farzaneh F，etal.The use of optical spectro scopy for in vivo detection of cervical pre-cancer〔J〕.Lasers Med Sci，2014；29(2)：831-45.

2葛 瑜，張 林，徐敬云，等.血清TSGF、CA125、CA19-9聯合SCC檢測在老年宮頸癌診斷中的價值〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(21)：5358-60.

3張曉麗.LKB1對宮頸癌細胞轉錄譜的影響及抑癌機制〔D〕.濟南：山東大學，2014.

4崔 潔，宋麗萍，趙 紅，等.周劑量順鉑和奈達鉑同步放療治療中晚期宮頸癌72例臨床分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；15(3)：358-61.

5Balleyguier C，Fournet C，BenHassen W，etal.Management of cervical cancer detected during pregnancy：role of magnetic resonance imaging〔J〕.Clin Imag，2013；37(1)：70-6.

6王素琴，安紅軍，徐勝東，等.老年宮頸癌患者首次治療的預后及危險因素〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(6)：1363-4.

7劉 晨.宮頸癌放射抗拒細胞株的建立及其抗拒機制的初步研究〔D〕.重慶：第三軍醫大學，2013.

8Uezono H，Tsujino K，Ota Y，etal.Pelvic insufficiency fracture after definitive radiotherapy for uterine cervical cancer：retrospective analysis of risk factors〔J〕.J Radiat Res，2013；54(6)：1102-9.