順氣化痰活血方對(duì)慢性間歇性低氧大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的干預(yù)作用

張 凱 吉恩生 常 悅 陳玲玲 郭秋紅

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200)

睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是臨床上多發(fā)的一種對(duì)身體多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響的睡眠呼吸障礙疾病。OSAS患者長(zhǎng)期的動(dòng)脈血氧飽和度波動(dòng)，造成慢性間歇性低氧(CIH)。 本研究利用CIH動(dòng)物模型，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，觀察順氣化痰活血方對(duì)CIH大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠60只，體重190～210 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組，每組20只。

1.2藥物及試劑 順氣化痰活血方組成：柴胡10 g，枳殼10 g，牛膝8 g，桔梗8 g，升麻8 g，葛根30 g，川芎12 g，當(dāng)歸12 g，桃仁12 g，紅花12 g，赤芍12 g，浙貝12 g，天麻20 g，蘇子12 g，陳皮12 g，半夏12 g，茯苓12 g，天南星12 g，瓜蔞12 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，薄荷10 g。上述藥物均采用中藥免煎配方顆粒，由廣東一方制藥有限公司提供。乙酰膽堿(ACh)、硝普鈉(SNP)和苯腎上腺素(PE)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3造模方法 參照文獻(xiàn)〔1〕建立CIH動(dòng)物模型，間歇性低氧艙采用自動(dòng)氣壓調(diào)控，程序設(shè)計(jì)每一低氧復(fù)氧循環(huán)時(shí)間為2 min，前1 min充N2使氧濃度降至9%，后1 min充O2使氧濃度恢復(fù)到21%。除對(duì)照組大鼠置于正常艙內(nèi)予空氣供氣外，其余2組大鼠在每日8～16時(shí)放入間歇性低氧艙中，共21 d。

1.4給藥方法 各組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，于造模第1天開始灌胃給藥。對(duì)照組、模型組給予生理鹽水1 ml/100 g；中藥組給予順氣化痰活血方1 ml/100 g(生藥量45 g/kg，相當(dāng)于成人劑量10倍)。每日灌胃1次，連續(xù)21 d。于最后1次灌胃給藥后，禁食不禁水12 h，麻醉狀態(tài)下打開胸腔，快速剝?nèi)⌒刂鲃?dòng)脈，用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5主動(dòng)脈組織一氧化氮(NO)含量測(cè)定 用半自動(dòng)分光光度計(jì)，硝酸還原酶法測(cè)定，以μmol/g 為單位。

1.6主動(dòng)脈組織ET-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡法，提取總蛋白，取80 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%胎牛血清(BSA)封閉，孵育一抗：內(nèi)皮素(ET)-1(1∶100)、GAPDH(1∶500)，TBST洗膜10 min×4次；孵育相應(yīng)二抗，TBST洗膜10 min×4次。加入電光學(xué)發(fā)光(ECL)，成像系統(tǒng)記錄并分析結(jié)果。

1.7主動(dòng)脈HE染色 將主動(dòng)脈用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下組織學(xué)觀察。

1.8主動(dòng)脈血管環(huán)舒張反應(yīng)性測(cè)定 制備3 mm長(zhǎng)主動(dòng)脈血管環(huán)，置于盛有8 ml K-H液的浴槽中，在1.5 g張力下穩(wěn)定60 min，以10-6mol/L PE刺激血管環(huán)，達(dá)到最大張力(Eo)后，給予10-6mol/L ACh或SNP，記錄血管張力(EX)，并計(jì)算最大血管舒張率：△E(%)=(Eo-EX)/Eo×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組主動(dòng)脈組織NO含量比較 與對(duì)照組〔(9.71±1.33)μmol/g〕比較，模型組主動(dòng)脈組織NO含量顯著降低〔(7.52±0.99)μmol/g,P<0.01〕；與模型組比較，中藥組NO含量顯著升高〔(9.16±1.51)μmol/g,P<0.05〕。

2.2各組主動(dòng)脈組織ET-1蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組(0.75±0.26)比較，模型組顯著增加(1.26±0.30，P<0.01)；與模型組比較，中藥組顯著降低(0.78±0.27，P<0.01)。見圖1。

2.3各組主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)比較 對(duì)照組主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整、排列有序；模型組主動(dòng)脈壁顯著增厚，內(nèi)皮細(xì)胞部分腫脹、脫落，內(nèi)膜明顯受損；中藥組主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)顯著恢復(fù)，內(nèi)膜光滑完整、內(nèi)皮細(xì)胞扁平連續(xù)。見圖2。

圖1 各組主動(dòng)脈組織ET-1蛋白表達(dá)

圖2 各組主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化(HE，×400)

2.4各組主動(dòng)脈血管環(huán)舒張功能比較 經(jīng)PE預(yù)刺激血管環(huán)收縮后，與對(duì)照組比較，模型組主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯降低(P<0.01)，經(jīng)中藥處理后的CIH大鼠主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯高于CIH大鼠(P<0.01)。各組主動(dòng)脈環(huán)對(duì)SNP的舒張反應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)ACh、SNP誘導(dǎo)的血管舒張率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

3 討 論

OSAS中醫(yī)稱鼾癥，由于睡眠時(shí)頻繁氣道阻塞，氣機(jī)循環(huán)運(yùn)行平衡被打破。故氣血逆亂，清濁相干，痰瘀阻塞為其主要病機(jī)，疏肝理氣、活血清熱、化痰開竅為其有效治法。課題組精心篩選了相應(yīng)藥物組成順氣化痰活血方，經(jīng)臨床運(yùn)用，療效滿意。方中以柴胡、桔梗、枳殼、牛膝，有升有降，疏理氣機(jī)；升麻、葛根，皆為辛散之品，取其“能散能行”之功，以發(fā)散行氣活血，升麻佐柴胡可調(diào)左右之清氣運(yùn)行。桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍，活血化瘀，以針對(duì)患者氣血阻滯之證。患者氣郁久而化熱，加之患者多為痰濕體質(zhì)，故用陳皮、半夏、天南星、茯苓、浙貝、蘇子、瓜蔞實(shí)、石菖蒲、黃芩，清熱化痰，散結(jié)開竅，薄荷引藥到咽喉。研究報(bào)道CIH可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂〔2，3〕。血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的損傷是血管內(nèi)皮功能受損的一個(gè)重要方面。與我們以往研究結(jié)果相同〔4〕，CIH損傷了血管內(nèi)皮功能，從而使血管對(duì)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)減弱，而對(duì)血管平滑肌功能未產(chǎn)生明顯影響。順氣化痰活血方可有效改善CIH后內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。ET-1、NO作為血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的敏感性標(biāo)志物〔5〕，CIH后主動(dòng)脈ET-1蛋白表達(dá)顯著增加，NO含量降低。本研究顯示，順氣化痰活血方可有效調(diào)節(jié)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ET-1/NO分泌，提示其可通過降低ET-1蛋白水平，增加NO含量以減輕血管內(nèi)皮損傷程度，改善血管內(nèi)皮功能。

1Liu Y，Ji ES，Xiang S,etal.Exposure to cyclic intermittent hypoxia increases expression of functional NMDA receptors in the rat carotid body〔J〕.Appl Physiol(1985)，2009；106(1)：259-67.

2Saarelainen S，Seppala E，Laasonen K，etal.Circulating endothelin-1 in obstructive sleep apnea〔J〕.Endothelium，1997；5(2)：115-8.

3Zamarron-Sanz C，Ricoy-Galbaldon J，Gude-Sampedro F，etal.Plasma levels of vascular endothelial markers in obstructive sleep apnea〔J〕.Arch Med Res，2006；37(4)：552-5.

4Guo QH，Tian YL，Wang Z，etal.Endothelin receptors in augmented vasoconstrictor responses to endothelin-1 in chronic intermittent hypoxia〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2013；40(7)：449-57.

5Ozard JR，Part ML.The role of nitric oxide in the regional vasodialtor effects of endothelin-1 in the rat〔J〕.Br J Pharmacol，1992；105(3)：744-50.