老年非小細胞肺癌患者支氣管肺泡灌洗液中視黃酸受體-β基因甲基化與P53突變的相關性

龔子龍 喻婉賢 姜 燕 范惠君

(武漢市第五醫院呼吸內科，湖北 武漢 430050)

支氣管肺泡灌洗液是指臨床通過利用支氣管鏡對老年患者支氣管以下肺段進行生理鹽水的灌洗并回收得到的具有診斷價值的灌洗液〔1〕。通過對回收的灌洗液進行檢測與分析，可以得知老年患者體內呼吸道的病變情況，其在肺癌中診斷中有臨床應用價值〔2～5〕。視黃酸受體(RAR)-β基因是編碼視黃酸β受體蛋白，其基因啟動子區及5′端第一個轉錄翻譯區富含CpG，在基因組上形成CpG島〔6〕。當RAR-β基因編碼區及啟動子區被高甲基化，基因表達沉默，從而導致細胞的生長和增殖不受控制，進而促進惡性腫瘤的發生，在正常人中，RAR-β基因的甲基化水平較低〔7〕。P53基因是人體普遍存在的一類抑癌基因，其突變的發生往往和腫瘤形成相關〔8〕。本研究分析肺癌老年患者支氣管肺泡灌洗液中RAR-β基因的甲基化水平及P53基因突變的發生率，旨在探討其在腫瘤發生發展過程中的作用及兩者相互關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 2014年4月至2016年4月武漢市第五醫院呼吸科就診的97例經病理確診為非小細胞肺癌老年患者為癌癥組，同時選取89例非肺癌老年患者為對照組。癌癥組男58例，女39例，年齡63～82歲，平均(75.7±8.6)歲；對照組男53例，女36例，年齡61～85歲，平均(74.3±9.2)歲。兩組年齡及性別分布差異無統計學意義(P>0.05)。癌癥組按照2009年國際TNM分期標準進行分期，其中Ⅰ期和Ⅱ期45例，Ⅲ期和Ⅳ期52例。

1.2主要試劑與儀器 全基因組DNA提取試劑盒，購自北京全式金生物(EasyPure Genomic DNA Kit，貨號EE101)；Mastercycler nexus聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀，購自Eppendorf公司；Tanon4200 SF全自動熒光/化學發光圖像分析系統，購自天能生物公司；2×TransTaq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix購自北京全式金生物(貨號AS131)；BisulFlashDNA甲基化修飾試劑盒購自Epigentek公司(貨號P-1026-050)；甲基化RAR-β特異的PCR擴增引物，未甲基化RAR-β特異的PCR擴增引物，P53基因的Exon5，Exon6，Exon7，Exon8特異的PCR擴增引物均由Invitrogen公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物信息

1.3樣本收集與DNA提取 首先對參與研究的老年患者進行支氣管鏡檢，以確定其病發部位；然后將鏡頭置入支氣管鏡頭于老年患者病發部位上游，采用多次灌洗，每次20 ml 37℃的生理鹽水進行沖洗，灌洗5次，然后通過負壓吸取支氣管肺泡灌洗液；對收集的灌洗液顯示采用雙層醫療紗布過濾后在4℃低溫，3 000 r/min離心10 min；取出離心管，棄去上清液體，回收離心得到的細胞殘渣，備用。嚴格按照使用操作說明書，完成對灌洗液細胞殘渣的基因組DNA的抽提。對提取得到的DNA，采用NanoDrop對DNA的總量及純度進行初步檢測，A260/A280比值在1.8～2.0，表明樣本純度較高。

1.4RAR-β基因甲基化檢測 對于由支氣管肺泡灌洗液中提取得到的DNA樣品，首先按照Bisul Flash DNA甲基化修飾試劑盒的操作說明，對DNA進行亞硫酸氫鈉處理后采用甲基化引物進行甲基化特異PCR，以區分RAR-β基因是否發生甲基化，步驟如下：PCR反應總體積20 μl，其中2×TransTaq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 10 μl，甲基化特異的PCR 正向和反向引物各 1 μl，修飾后的DNA模板2 μl，加入6 μl ddH2O將反應體系補至20 μl；PCR擴增條件為：預變性：95℃ 2 min；擴增(36個循環)：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。對于PCR擴增的結果，采用凝膠電泳進行檢測，其中利用甲基化特異的引物進行PCR擴增，并且檢測到目的條帶，則表明RAR-β基因是被甲基化的；若是PCR完成后，只有非甲基化特異的引物有目的條帶擴增，則RAR-β基因未被甲基化。

1.5P53基因突變的檢測 以從灌洗液中得到的DNA樣品為模板，采用特異性PCR引物，分別對P53基因的Exon5，Exon6，Exon7，Exon8進行擴增。PCR體系配制如下：采用50 μl PCR體系，其中 2×TransTaq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 25 μl，基因特異的PCR正向和反向引物各2 μl，提取的基因組DNA樣品4 μl，加入17 μl ddH2O將反應體系補至50 μl；PCR擴增條件：預變性：95℃ 2 min；擴增(36個循環)：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。回收PCR擴增產物，并送生工生物進行PCR擴增片段的雙向測序，驗證P53各個外顯子的突變情況。

1.6統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件進行χ2檢驗或Fisher精準檢驗、Spearman相關分析。

2 結 果

2.1肺癌組RAR-β基因甲基化檢測 對PCR擴增的產物，采用2%的凝膠電泳進行電泳分離，并在凝膠成像儀上進行檢測，部分結果見圖1。

3、4、5.檢測到RAR-β基因甲基化；6.未檢測到RAR-β基因甲基化；11、12.未檢測到RAR-β基因甲基化；13、14.檢測到RAR-β基因甲基化；M.甲基化引物擴增結果；U.未甲基化引物擴增結果圖1 肺癌老年患者支氣管肺泡灌液中RAR-β基因甲基化檢測結果

2.2兩組RAR-β基因甲基化及P53基因突變比較 癌癥組RAR-β基因甲基化發生率(53.61%)與正常組(17.98%)差異有統計學意義(χ2=25.41,P<0.05)；測序分析結果顯示，P53在肺癌灌洗液中突變率(43.30%)較對照組(7.87%)明顯高(χ2=30.03,P<0.05)。

2.3不同臨床分期的肺癌老年患者中RAR-β基因的甲基化及P53基因的突變比較 Ⅰ、Ⅱ期肺癌老年患者支氣管肺泡灌洗液中RAR-β基因的甲基化陽性率為42.22%(19/45)，Ⅲ、Ⅳ期甲基化陽性率顯著升高為63.46%(33/52)，差異有統計學意義(χ2=4.38,P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ期的肺癌老年患者支氣管肺泡灌洗液中P53基因的突變率為22.22%(10/45)，Ⅲ、Ⅳ期P53基因的突變率則顯著升高為61.54%(32/52)，差異有統計學意義(χ2=15.19,P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ期支氣管肺泡灌洗液中，RAR-β基因甲基化和P53基因的突變檢出率差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4RAR-β基因甲基化與P53基因突變的相互關系 RAR-β基因甲基化發生時，P53基因突變率為67.31%(35/52)，而當RAR-β 基因甲基化未發生時，P53基因突變率僅為15.56%(7/45)，差異有統計學意義(P<0.05)；同樣的，當P53基因突變發生時，肺癌老年患者RAR-β 基因甲基化的發生率為83.33%(35/42)，而在P53基因未發生突變組，肺癌老年患者RAR-β 基因甲基化的發生率降低為30.91%(17/55)，差異有統計學意義(χ2=26.32,P<0.05)。RAR-β基因甲基化水平與P53基因突變呈正相關(r=0.521，P<0.05)。

3 討 論

老年患者被確診為肺癌時，多數已屬于肺癌晚期，因此肺癌的早期診斷及治療對提高老年患者的生存率及預后有重要意義〔2〕。對于肺癌的診斷，先前主要是通過侵入性摘取患者肺部組織，進行組織病理學分析進行確診〔8〕。近些年來隨著支氣管肺泡灌洗術的臨床應用，通過對灌洗液中脫落的組織細胞及相關基因進行篩選已成為肺癌輔助診斷的重要手段〔9〕。但是由于灌洗液中脫落的細胞不穩定、易降解等特點，導致實際的檢出率較低〔10〕。隨著生物技術的進步，PCR技術在擴增目的DNA時，具有高靈敏度和高特異性，被引入到該類檢測反應中，從而有助于提高對肺癌灌洗液中相關基因表達和突變的檢測等〔11〕。

RAR-β基因編碼的視黃酸β受體蛋白，能夠介導與視黃酸的結合，從而參與調控相關靶基因的轉錄過程，達到抑制癌癥發生發展的效應〔12〕。腫瘤組織中RAR-β基因的啟動子區存在異常高水平的甲基化，或許是其表達沉默的主要原因〔13〕；肺癌發生的早期階段，檢測到大量的抑癌基因啟動子區域的高甲基化，表明RAR-β基因的甲基化可能與肺癌的早期形成密切相關，暗示著其或許能作為肺癌發生的腫瘤標志物〔14，15〕。而P53基因是人體普遍存在的一類抑癌基因，在多數腫瘤組織中均能檢測到其突變〔16，17〕。

本研究表明RAR-β甲基化及P53基因突變與癌癥的發生密切相關，與部分學者的研究結果較為一致〔18〕；本文表明隨著肺癌的發展，RAR-β基因的甲基化水平越高，P53基因的突變發生檢出率越明顯，提示RAR-β基因及P53 基因可能參與了肺癌的發展過程；兩者在肺癌的發展過程中可能存在著相互協同的效果；肺癌發展的前期，對老年患者RAR-β基因甲基化水平檢測的臨床診斷價值要高于P53基因突變。

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