柱前衍生HPLC法研究亮菌口服溶液中游離氨基酸和總氨基酸含量

李盼盼，胡佳楠，左利民，朱志玲，姚靜，山廣志

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柱前衍生HPLC法研究亮菌口服溶液中游離氨基酸和總氨基酸含量

李盼盼，胡佳楠，左利民，朱志玲，姚靜，山廣志

100050 北京，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所分析測試中心（李盼盼、胡佳楠、左利民、朱志玲、山廣志）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院抗腫瘤與放射藥品室（姚靜）

亮菌口服溶液是由真菌——假蜜環菌發酵提取而制得的一種多組分藥物，其成分復雜，內含亮菌素、多糖、氨基酸、蛋白質等多種成分，具有解痙、鎮痛、消炎、退黃疸以及降低谷丙轉氨酶、γ-谷氨酰轉肽酶和膽紅素等作用，主要用于治療慢性肝炎，遷延性肝炎，慢性膽管炎，膽囊炎以及慢性、淺表性、萎縮性胃炎，還可用于放療、化療引起的白細胞減少的輔助治療。亮菌口服溶液富含游離氨基酸和蛋白，建立和考察亮菌口服溶液中游離氨基酸及蛋白質，有助于提升和完善該品種的質量標準，揭示其藥效成分。

目前多肽、蛋白的測定方法主要有雙縮脲法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法等。但由于亮菌口服液成分復雜，干擾物質多，很難通過顯色法測定。

現有氨基酸測定方法主要包括氨基酸衍生儀法[1-2]、離子色譜法[3]、柱前衍生法[4-7]、氣相色譜法[8]及其他方法[9]。前兩種方法需要專門儀器，普適性差。柱前在線衍生高效液相色譜法簡單、重復性好，是目前氨基酸測定最常用的方法。

本實驗利用蛋白質在酸性條件下水解為氨基酸，通過柱前在線衍生高效液相色譜法測定水解后總氨基酸以及未水解的游離氨基酸含量，間接評估亮菌口服溶液中蛋白含量。經方法學驗證，本法重復性好，專屬性強，對全面評估亮菌口服溶液中總氨基酸及游離氨基酸水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1200 型液相色譜系統為美國 Agilent 公司產品，配有在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器；Chromeleon 7.2 色譜工作站為美國 Thermo Fisher Scientific 公司產品；ME204 型萬分之一電子分析天平、XP205 型十萬分之一電子分析天平和 Seven easy pH 計均為瑞士Mettler Toledo 公司產品； Milli-Q Integral 型超純水機為德國 Merck Millipore 公司產品。

1.1.2 藥品與試劑 17 種氨基酸混合對照溶液購自美國 Agilent 公司（批號BCBS9033V，濃度 250 pmol/μl；批號 BCBS1015V，濃度 10 pmol/μl；批號 BCBS4361V，濃度25 pmol/μl）和美國 Sigma Aldrich 公司（批號 SLBL5862V，濃度 2.5 μmol/μl）；18 種氨基酸標準品購自中國藥品生物制品檢定所（批號 140624-200805）；市售亮菌口服溶液分別為企業 A（批號 170101）和企業 B（批號 150406）生產；OPA 衍生試劑（批號 BCBT4337）和 FMOC 衍生試劑（批號 BCBS4366V）均購自美國 Agilent 公司；甲醇、乙腈均為市售色譜級；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：保護柱：Capcell PAK C18 MG（4.0 mm × 10 mm，3 μ），分析柱：Capcell PAK C18 MG（150 mm × 4.6 mm，3 μ）；流動相：以含 10 mmol/L 磷酸氫二鈉和 10 mmol/L硼酸鈉的緩沖溶液（pH 8.2）為流動相 A，以乙腈-甲醇-水（體積比 45:45:10）為流動相 B。梯度洗脫，0 ~ 0.5 min，A 相 98%；0.5 ~ 20 min，A 相43%；20.1 ~ 23.5 min，A 相 0%；23.6 ~ 30 min，A 相 98%。流速 1.5 ml/min，柱溫 40 ℃，分時間變波長檢測，0 ~ 18.5 min 為 338 nm，18.5 ~ 30 min 為 262 nm，自動衍生步驟：吸取硼酸鹽緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.2）2.5 μl；吸取樣品1.0 μl；空氣中最大速度 3.5 μl 混合 5 次；等待 0.2 min；吸取OPA 衍生劑 0.5 μl；空氣中最大速度 4.0 μl 混合10 次；吸取FMOC 衍生劑 0.4 μl；空氣中最大速度 4.4 μl 混合 10 次；吸取進樣溶劑 32 μl；空氣中最大速度20 μl 混合 8 次；進樣。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液 以濃度為 250 pmol/μl 的 17 種氨基酸混合溶液作為混合對照品溶液。

1.2.2.2 游離氨基酸供試品溶液 精密量取亮菌口服溶液 2 ml，置 10 ml 量瓶中，加 1.5% 磺基水楊酸稀釋至刻度，靜置 24 h 以沉淀蛋白，離心，取上清液過濾后作為游離氨基酸供試品溶液。

1.2.2.3 總氨基酸供試品溶液 精密量取亮菌口服溶液2 ml 置耐壓水解管中，加 10 mol/L 鹽酸溶液 8 ml，密封，置 120 ℃水解 24 h，放冷，啟封，全量轉移至蒸發皿中，置水浴上蒸發至干，殘渣加 0.1 mol/L 鹽酸溶解并定量稀釋至 10 ml，搖勻，過濾，取續濾液作為總氨基酸供試品溶液。

1.2.2.4 空白溶液 以 0.1 mol/L 鹽酸作為空白溶液。

1.2.2.5 進樣溶劑 100 ml 流動相 A 加入 0.25 ml 磷酸，混勻后即得。

1.2.3 專屬性實驗 取空白溶液、對照品溶液、游離氨基酸供試品溶液、總氨基酸供試品溶液各 1 μl 注入液相色譜儀，以考察各溶液中其他組分對氨基酸測定的影響。

1.2.4 線性關系考察 精密量取 17 種氨基酸對照品（除胱氨酸濃度為 1.25 μmol/ml 外，其他氨基酸濃度為 2.5 μmol/ml），用 0.1 mol/L 的鹽酸稀釋成氨基酸濃度分別為 1.2500、0.8333、0.6250、0.5000、0.2500、0.1250、0.06250、0.03125 μmol/ml 的系列對照品溶液。按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定。

1.2.5 定量限與檢出限 取“1.2.2.1”項下對照品溶液適量，逐步稀釋，當信噪比為 10:1時，作為定量限（LOQ）；當信噪比為 3:1 時，作為檢測限（LOD）。

1.2.6 精密度試驗 取“1.2.2.1”項下對照品溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖考察精密度。

1.2.7 穩定性試驗 取“1.2.2.3”項下總氨基酸供試品溶液，在室溫下放置 0、4、8、12 h 后分別進樣測定，記錄色譜圖，考察樣品穩定性。

1.2.8 重復性試驗 取批號為 170101 的亮菌口服溶液適量，按“1.2.2.3”項下方法制備總氨基酸供試品溶液，共6 份，再按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

1.2.9 回收率試驗 取批號為 170101 的亮菌口服溶液，按“1.2.2.3”項下方法制備總氨基酸供試品溶液。精密量取上述總氨基酸供試品溶液 2.0 ml，分別置于 9 個 10 ml 量瓶中，加入 L-Glu、L-Ala、L-Leu 濃度分別為 0.5012、0.2032、0.1512 mg/ml 的對照品溶液 2、3、4 ml 各 3 份，用 0.1 mol/L 鹽酸稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.10 樣品含量測定 取兩廠家 2 批次口服液，按“1.2.1”項下條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算游離氨基酸和總氨基酸含量。

2 結果

2.1 專屬性試驗

在本色譜條件下，空白溶液、稀釋溶劑、衍生劑以及制劑中存在的其他組分不影響游離氨基酸和總氨基酸的測定，色譜圖見圖 1。結果表明，本方法的專屬性良好。

圖 1 HPLC 色譜圖[A：空白溶劑；B：對照品溶液（250 pmol/μl）；C：游離氨基酸供試品溶液；D：總氨基酸供試品溶液；1：L-天冬氨酸；2：L-谷氨酸；3：L-絲氨酸；4：L-組氨酸；5：L-甘氨酸；6：L-蘇氨酸；7：L-精氨酸；8：L-丙氨酸；9：L-酪氨酸；10：L-半胱氨酸；11：L-纈氨酸；12：L-蛋氨酸；13：L-苯丙氨酸；14：L-異亮氨酸；15：L-亮氨酸；16：L-賴氨酸；17：L-脯氨酸]

2.2 線性試驗

各氨基酸成分濃度（x）與峰面積（y）線性關系良好，結果見表 1。

2.3 檢出限與定量限

各氨基酸的檢出限和定量限結果見表 1。

2.4 精密度試驗

各氨基酸的峰面積的 RSD 在 0.39% ~ 2.34% 之間（n = 6），表明方法精密度良好。

2.5 穩定性試驗

總氨基酸測定結果的 RSD 為 2.24%，表明供試品溶液在室溫條件下 12 h 內穩定。

2.6 重復性試驗

總氨基酸測定結果的 RSD 為 2.41%（n = 6），表明方法重復性良好。

2.7 回收率試驗

各氨基酸的回收率在 89.66% ~ 106.4% 之間，表明方法回收率良好。

2.8 樣品含量測定

A 廠家（批號 170101）和B 廠家（批號 150406）樣品中游離氨基酸和總氨基酸的計算結果見表 2。

表 1 線性關系及檢出限、定量限結果

表 2 樣品含量測定結果（μg/ml）

注：*結構氨基酸含量= 總氨基酸–游離氨基酸；**ND：未檢出。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

大多數氨基酸紫外吸收較弱或無紫外吸收，通常通過鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）及二甲氨基萘磺酰氯（Dansyl-Cl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）等衍生試劑將氨基酸衍生后，由紫外檢測器或熒光檢測器檢測。離線衍生方法耗時較長、操作均一性差，本研究采用帶全自動衍生功能的自動進樣器在線衍生，以鄰苯二甲醛和 9-芴甲基氯甲酸酯為衍生試劑，有效消除了離線衍生由于進樣時間不同和手工操作速度慢、不均一造成的誤差，在保證準確性的前提下，簡化操作過程，降低工作強度。

3.2 保護柱使用的必要性

亮菌口服溶液樣品基質復雜，存在大量多糖及小分子成分。在游離氨基酸測定過程中，即使進行了蛋白沉淀和過濾，仍然會出現色譜柱污染和超壓（系統壓力緩慢增加）等情況。而水解樣品對系統壓力幾乎無影響。初步判斷是由于樣品中存在的多糖成分導致系統污染，而水解成為單糖后對系統影響減弱。因此在該實驗中使用了預柱，預柱的使用可以有效延長分析色譜柱的使用壽命。在樣品測定過程，若隨著游離氨基酸供試品進樣，系統壓力增加到一定值后，應及時更換保護柱。進樣過程中，當色譜峰柱效突然下降，更換新的預柱峰型依然無法改善時，應及時對色譜柱進行沖洗和活化。

3.3 氨基酸的組成分析

研究結果顯示，亮菌口服液中含有較為豐富的氨基酸。游離氨基酸含有除 L-組氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸及L-甲硫氨酸外的 13 種氨基酸，種類分布較為均勻。總氨基酸中檢出除 L-酪氨酸和 L-甲硫氨酸外的 15 種氨基酸，L-精氨酸的測定結果低于游離氨基酸中精氨酸含量，可能由于在加熱酸水解過程中 L-精氨酸部分破壞所致。亮菌口服液中含有豐富的蛋白及多肽成分（2.5 mg/ml 以上），組成蛋白及多肽的結構氨基酸以酸性氨基酸（L-Asp 和 L-Glu）含量較高，兩種酸性氨基酸含量占組成蛋白氨基酸的 35% ~ 40%。

在線自動衍生方法在分離性能、線性范圍、精密度、準確度方面均能滿足測試需要，專屬性強，重現性好，17 種游離氨基酸的濃度與峰面積線性關系良好，適用于亮菌口服溶液中游離氨基酸和總氨基酸的日常檢驗和生產控制。

[1] Ge CY, Pang H, Li N, et al. Content analysis and comparative study of amino acids in ejiao from 18 manufacturers. China Pharm, 2017, 28(1):122-126. (in Chinese)

葛重宇, 龐慧, 李楠, 等. 18家企業阿膠中氨基酸的含量分析與比較研究. 中國藥房, 2017, 28(1):122-126.

[2] Wang SP, Liu HZ, Zhou YH, et al. Component analysis of amino acids in the culture supernatant of bacillus strains isolated from porcine intestinal tract. Amino Acids Biotic Resource, 2016, 38(2):16-22. (in Chinese)

王升平, 劉惠知, 周映華, 等. 來自豬腸道芽胞桿菌培養液中氨基酸成分分析. 氨基酸和生物資源, 2016, 38(2):16-22.

[3] Zhang YP, Yi RZ, Chen H, et al. Determination of the hydroxyproline in scale collagen protein by ion chromatography. Chin J Mar Drugs, 2011, 30(4):45-48. (in Chinese)

張怡評, 易瑞灶, 陳暉, 等. 離子色譜法測定魚鱗膠原蛋白中羥脯氨酸含量方法的研究. 中國海洋藥物, 2011, 30(4):45-48.

[4] Chen C, Zhang H. Determination the content of amino acid in Shiquan Dabu herb paste by HPLC. Asia-Pacific Traditional Med, 2017, 13(7): 17-19. (in Chinese)

陳成, 張浩. HPLC法測定十全大補膏滋劑中氨基酸成分的含量. 亞太傳統醫藥, 2017, 13(7):17-19.

[5] Sun YJ, Li RH. Comparative analysis of the contents of amino acids in platycladus orientalis leaves from different origins and before and after being processed. Asia-Pacific Traditional Medi, 2017, 13(8):52- 55. (in Chinese)

孫延君, 李瑞海. 不同產地側柏葉藥材及炮制前后氨基酸成分比較分析. 亞太傳統醫藥, 2017, 13(8):52-55.

[6] Chen Z, Lu J, Peng JM, et al. Simutaneous determination of 14 amino acids in Pfaffia by RP-HPLC with pre-column derivatization. J Pharm Pract, 2017, 35(2):130-133. (in Chinese)

陳哲, 路娟, 彭紀銘, 等. 柱前衍生RP-HPLC法同時測定琺菲亞中14種水解氨基酸. 藥學實踐雜志, 2017, 35(2):130-133.

[7] Shan GZ, Zuo LM, Yu L, et al. Determination of 17 kinds of free amino acids in oral solution of spleen amino peptide by HPLC with pre-column derivatization. Chin J New Drugs, 2013, 22(11):1255- 1258, 1268. (in Chinese)

山廣志, 左利民, 余立, 等. 柱前衍生HPLC法測定脾氨肽口服液中17種游離氨基酸. 中國新藥雜志, 2013, 22(11):1255-1258, 1268.

[8] Zhou F, Liu S, Deng MR, et al. Determination of amino acids in Eucommia ulmoides Oliv leaves by gas chromatography-mass spectrometry/selected ion monitor. Central South Pharm, 2012, 10(4): 257-260. (in Chinese)

周芳, 劉韶, 鄧夢如, 等. GC-MS/SIM法測定不同產地杜仲葉中的氨基酸. 中南藥學, 2012, 10(4):257-260.

[9] Jin SY, Liu H, Guo H, et al. Simultaneous determination of 17 amino acids in sarcocarp of northeast empetrum nigrum by HPLC-ELSD. China Pharm, 2017, 28(9):1272-1274. (in Chinese)

金司陽, 劉寒, 郭慧, 等. HPLC-ELSD法同時測定東北巖高蘭果肉中17種氨基酸的含量. 中國藥房, 2017, 28(9):1272-1274.

中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程系統創新團隊基金（2016-I2M-3-010）

山廣志，Email：shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn；姚靜，Email：yaojh@163.com

2017-10-10

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.016