白細胞介素12對耐藥結核大鼠模型的影響

李昱，楊庚

?

白細胞介素12對耐藥結核大鼠模型的影響

李昱，楊庚

710086 西安，武警工程大學醫院衛勤科（李昱），檢驗科（楊庚）

觀察、評價白細胞介素 12（IL-12）對耐藥結核大鼠模型的臟器菌落變化和細胞因子水平的影響。

將 60 只 SD 雌性大鼠經尾靜脈感染結核分枝桿菌耐利福平株，每只 106CFU，制成耐藥結核大鼠模型，隨機分為對照組和 IL-12 組，每組 30 只。給予 PBS 或 IL-12 治療 7 d，ELISA 法檢測血清 IFN-γ 水平、流式細胞術行 T 細胞亞群檢測和平板計數法測定器官菌落計數，觀察治療后生存率。

IL-12 組大鼠 1 只死亡，肺、肝、脾菌落數分別為（254 ± 98）× 105、（5 ± 2）× 105和（16 ± 4）× 105CFU/ml，IFN-γ（1125 ± 378）pg/ml；PBS 組 10 只死亡，肺、肝、脾菌落數分別為（682 ± 304）× 105、（28 ± 17）× 105和（108 ± 35）× 105CFU/ml，IFN-γ（532 ± 198）pg/ml，兩組比較差異有顯著性。淋巴細胞亞群測定顯示 IL-12 促進 Th1 細胞反應，改變了 Th1/Th2 平衡，兩組比較差異有顯著性。

IL-12 誘導 IFN-γ 產生，促進 Th1 細胞反應，改變了 Th1/Th2 平衡，對結核分枝桿菌感染大鼠產生保護效應。

白細胞介素 12； 廣泛耐藥結核； 大鼠； 白細胞介素 18； Th1-Th2 平衡

半個世紀以來，結核病的傳染性在全球一直高居前列[1]。隨著社會經濟和醫學技術的發展，耐多藥結核病儼然成為結核病控制工作的重中之重，嚴重威脅人們在結核病控制領域取得的成就。患者在治療時常常由于出現不良反應而失去繼續治療的信心，治療依從性大大降低。而耐多藥結核病疫情回升已成為威脅全球的公共衛生問題。我國作為全球 27 個耐多藥肺結核高負擔國家之一，每年新發耐多藥結核患者位居全球第二位。

隨著結核病學的發展和研究，抗結核藥物的開發和應用使得結核病的傳染得到了有效控制[2]。異煙肼（INH）和利福平（RFP）是目前醫學上抗結核病應用最為廣泛的一線藥品，是決定結核病治療效果和治療方案的關鍵因素之一[3-5]。然而，由于長期大劑量的藥物使用，耐藥菌株不斷產生。已有研究表明，利福平耐藥性結核分枝桿菌往往會同時表現出多種耐藥性，因此，研究耐利福平結核病對結核患者的治療具有重要意義。此外諸多研究還表明，結核分枝桿菌的機體感染可能引起較為強烈的機體免疫反應。其免疫反應主要表現在：T 細胞亞群比例失衡；γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素 12（IL-12）等細胞因子分泌水平明顯上調。這提示這些淋巴細胞的分化和細胞因子分泌水平的變化可能會有助于緩解結核病的發展。

傳統的化學藥物療法已頗顯弊端，近年來更具針對性的生物免疫因子療法成為解決這一難題的重要手段[6-8]。IL-12 主要由單核細胞、巨噬細胞等產生，近年來在抗病毒感染、抗寄生蟲入侵和抗腫瘤等方面表現出了極佳的療效[9-11]，并日益受到免疫學家的青睞。作為一種具有多種活性的生物免疫應答調變器，IL-12 可以促進 T 細胞增殖活化，誘導 T0 細胞向 Th1 分化，提高 Th1/Th2 的比例；可刺激多種免疫細胞 IFN-γ、IL-2、TNF-α 等細胞因子，進而提高機體殺滅病原微生物的能力[12-14]。本研究旨在通過IL-12 對耐藥結核模型大鼠的治療，探究實驗動物臟器菌落、細胞因子水平以及T 淋巴細胞亞群比例的影響，以研究IL-12 對耐利福平結核分枝桿菌感染實驗動物的保護作用，以期為結核病的生物免疫因子治療提供借鑒和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康 SD 大鼠 60 只，雄性，約 2.5 月齡，體重 300 ~ 350 g，由陜西省醫學實驗動物中心實驗室提供。室溫 25 ℃，濕度 50% ~ 80%，SPF 環境下自由飲水和采食。

1.1.2 儀器與試劑 PBS 磷酸緩沖液由美國Hyclone 公司提供；細菌培養箱購自北京金恒祥儀器有限公司；CD3（APC-CD3）、葉綠素熒光蛋白（PreCP）等免疫抗體購自美國 Santa Cruz 公司；ELISA 試劑盒購自南京建成生物有限公司；結核分枝桿菌耐利福平株購于中國疾病預防控制中心結核病防治臨床中心。

1.2 方法

1.2.1 建立實驗模型及實驗分組 將 60 只 SD 大鼠經尾靜脈注射結核分枝桿菌耐利福平株，106CFU/只，制成耐藥結核大鼠模型。將所有實驗動物平均隨機分為兩組，即對照組和 IL-12 組。對照組大鼠每只腹腔注射 200 μl PBS 磷酸緩沖液，IL-12 組腹腔注射 200 μl 重組大鼠 IL-12（含有 0.2 μg IL-12 的 PBS 溶液），從結核分枝桿菌感染大鼠后當天下午開始，連續腹腔注射 7 d。

1.2.2 ELISA 法檢測血清 IFN-γ 水平 連續給藥 7 d 后，各實驗組分別取 10 只大鼠稱重，按照 0.3 ml/100 g 注射 100 g/L 水合氯醛溶液麻醉，眼球抗凝管采血備用。取部分大鼠血液，4000 r/min離心機離心取血清，用 ELISA 試劑盒測定 IFN-γ 含量。

1.2.3 器官菌落計數 取新鮮大鼠肺、肝、脾臟的全份臟器，10 000 r/min 組織勻漿，30 s 制成組織勻漿液。用高溫滅菌的 PBS 對實驗動物的臟器勻漿液以 1:10 的重量體積比進行稀釋，按1 × 102/ml將其接種在結核分枝桿菌平板羅氏培養基上，細菌培養箱培養 23 d 后統計菌落數。

1.2.4 大鼠臟器中結核分枝桿菌 HE染色 將大鼠的胸腹腔剖開用注射器吸取滅菌生理鹽水，將針頭準確刺入心腔，緩慢注入 10 ml 進行心臟的灌流。將肺、肝、脾取出放入平皿中，置于冰上，用 PBS 緩沖液進行沖洗。取各部分組織固定，經分級系列酒精脫水，縱向切片，厚度約 20 μm。行 HE 及抗酸染色，并觀察。

1.2.5 流式細胞術行 T 細胞亞群檢測 取新鮮外周靜脈血 3 ml，密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞，隨后離心洗滌兩次；將外周血淋巴細胞重懸于 1 ml RPMI1640 培養液中，調整 PBMC 濃度為 1.00 × 106/ml。以加入 50 μg/ml PMA 和 0.75 μg/ml 離子霉素的 RPMI1640 培養液對外周血淋巴細胞進行刺激，置于細胞培養箱中培養 4 h 后，取出離心洗滌，加入 APC-CD3 抗體、PreCP-CD8 抗體表面標記染色細胞，室溫避光孵育 15 min，洗滌后破膜，再次洗滌后加入 FITC-IFN-γA 和 PE-IL-4A 抗體?室溫避光孵育并洗滌后，用 PBS 磷酸緩沖液重懸細胞，18 ~ 24 h 內流式細胞術檢測 Th1 細胞和 Th2 細胞?每份樣品計數 20 000 ~ 30 000 個細胞?

1.2.6 觀察治療后生存率 觀察剩余的 40 只大鼠的存活情況，以結核桿菌感染當天開始計時，觀察 60 d 后各實驗組大鼠的生存率。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 血清 IFN-γ 水平檢測結果

與對照組大鼠血清中 IFN-γ 水平[（532 ±198）pg/ml]相比，IL-12 組大鼠血清中的 IFN-γ 水平顯著提高[（1125 ± 378）pg/ml]，差異具有顯著性意義（< 0.05）。

2.2 各組器官菌落計數

如表 1 可知，即對照組大鼠 3 個臟器中結核分枝桿菌菌落數均顯著高于 IL-12 組，差異具有顯著性意義（0.05）。由圖1 可見，對照組大鼠3 個臟器可見慢性肉芽腫性炎性改變，對照組較 IL-12 組明顯。

表 1 IL-12 對耐藥結核分枝桿菌感染大鼠模型肺臟、肝臟和脾臟中菌落數目的影響（× 105 CFU）

注：與對照組比較，< 0.05。

Note: Compared with control group,< 0.05.

2.3 血液 T 淋巴細胞亞群的變化

如表 2 所示，與對照組相比，IL-12 組大鼠血液中 Th1、Th2、Th1/Th2 細胞百分率均升高（均< 0.05）。

圖 1 各組大鼠 3 個臟器中結核分枝桿菌觀察（HE × 40）

Figure 1 Observation of mycobacterium tuberculosis in 3 organs of rats in each group (HE × 40)

表 2 IL-12 對耐藥結核桿菌模型大鼠血液中=Th1/Th2 的影響（%）

Table 2 The effect of IL-12 on the blood Th1/Th2 in the ratmodel of drug-resistant mycobacterium tuberculosis (%)

組別 GroupsTh1Th2Th1/Th2 對照組 Control group2.73 ± 0.251.78 ± 0.321.69 ± 0.27 IL-12組 IL-12 group5.41 ± 0.46*2.54 ± 0.41*2.64 ± 0.24*

注：*與對照組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

2.4 治療后生存率

腹腔注射大鼠 60 d 后，記錄兩個實驗組共40 只大鼠的存活情況。結果顯示，對照組大鼠死亡 10 只，生存率50%，而 IL-12 組大鼠死亡1 只，生存率95%。

3 討論

IL-12 是機體內一種重要的生物免疫調節劑，常作為聯系先天固有免疫和后天獲得性免疫的橋梁而發揮特殊的免疫作用[15-17]。IL-12 可以誘導 T 淋巴細胞亞群的免疫應答平衡變化，引起Th1 的增殖和分化并增強 T 細胞的免疫能力，促進 T 淋巴細胞和自然殺傷細胞分泌更高水平的 γ 型干擾素。外源性 IL-12 也常作為免疫調節劑使用[18-20]，外源 IL-12 可以誘導淋巴細胞表面 IL-2 受體的高水平表達，而 IL-2 又可以誘導 IL-12 受體的表達增強，進一步提高機體的免疫反應水平。世界衛生組織發布的《2017 全球結核病報告》指出，結核病為全球第九大致死疾病，甚至高于艾滋病。2016 年，全球HIV 陰性人群中有約 130 萬結核病患者，HIV 呈陽性人群中有 37.4 萬人因結核病死亡。隨著利福平等藥物的臨床應用，耐藥性結核分枝桿菌的危害也在逐年增加。因此，尋求具有針對性且安全有效的治療手段迫在眉睫。

本實驗通過尾靜脈注射耐藥性結核分枝桿菌構建結核病大鼠模型，并腹腔注射外源性IL-12，探討了外源 IL-12 腹腔注射治療干預對結核病大鼠的保護效應。結果顯示，IL-12 的腹腔干預治療顯著提高了實驗大鼠血清中干擾素-γ 的分泌水平，提高了 Th1 淋巴細胞的數目并調節了 Th1/Th2 平衡，顯著降低了大鼠臟器中結核分枝桿菌數目；顯著延長了實驗動物的存活時間并明顯降低了大鼠的死亡率。這與張天托等[21]的研究結果較為一致。IL-12 可以誘導 Th0 向 Th1 細胞的分化，促使 T 淋巴細胞亞群平衡的漂移，此系 IL-12 干預治療結核病的重要機制之一。Th1 是分泌 IFN-γ 細胞因子的重要淋巴細胞，且 IFN-γ 具有選擇 Th1 細胞亞群為主要免疫應答的特點。IFN-γ 可正反饋加強自身優勢，進一步影響 Th1/Th2 兩種亞群之間的平衡。干擾素-γ 是抗結核的重要免疫細胞因子，其可以協同巨噬細胞殺滅機體內的結核分枝桿菌，并且阻止結核菌的擴散[22]。

IL-12 可通過誘導 IFN-γ 分泌，抑制 IL-4 合成，從而調節 Th1/Th2 平衡，對結核分枝桿菌感染患者產生保護性的免疫反應。IL-12 尤其適應細胞免疫功能低下宿主合并結核分枝桿菌感染的狀態，其可作為結核免疫調節劑，對結核新疫苗的開發研制具有指導意義。陳敬等[23]對 25 例結核患者的研究表明，IL-12 可以通過誘導 IFN-γ 的分泌，起到抑制 IL-4 合成，從而調節Th1/Th2 平衡的作用，對結核分枝桿菌感染患者產生保護性的免疫反應。IL-12 能夠作為結核免疫調節劑，并可用于開發結核新疫苗。因此，人為免疫細胞因子干預治療可以有效控制結核病，本實驗的成功為結核病的免疫治療開拓了新的途徑和思路。

綜上所述，我們認為 IL-12 作為免疫細胞因子在自身免疫性疾病等方面的治療中有著廣闊的應用前景。有關IL-12 的治療時機、最佳劑量、毒副作用和合并使用抗結核藥物的相互關系以及療程、安全性、療效等問題仍需多中心、大樣本、觀察期長的臨床研究提供更有力的依據，積累更多的臨床用藥經驗，以便更好地指導臨床治療工作。

[1] Pang Y, Xia H, Jiang GL, et al. Genotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis from China. Chin Jo Lab Med, 2011, 34(11):1023-1028. (in Chinese)

逄宇, 夏輝, 姜廣路, 等. 中國結核分枝桿菌寡核苷酸基因分型及其耐藥性分析. 中華檢驗醫學雜志, 2011, 34(11):1023-1028.

[2] Xu LQ, Yu H. Advances in molecular mechanism of mycobacterium tuberculosis drug resistance. Lab Med Clin, 2009, 6(11):887-890. (in Chinese)

徐龍強, 于紅. 結核分支桿菌耐藥的分子機制研究進展. 檢驗醫學與臨床, 2009, 6(11):887-890.

[3] Pang Y, Li GL, Wang YF, et al. Study on the molecular mechanism of mono-rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. ChinJ Antituberculosis, 2012, 34(5):275-279. (in Chinese)

逄宇, 李桂蓮, 王玉峰, 等. 單耐利福平結核分枝桿菌耐藥分子機制研究. 中國防癆雜志, 2012, 34(5):275-279.

[4] Rodríguez AM, Pascutti MF, Maeto C, et al. IL-12 and GM-CSF inDNA/MVA immunizations against HIV-1 CRF12_BF Nef inducedT-cell responses with an enhanced magnitude, breadth and quality. PLoS One, 2012, 7(5):e37801.

[5] Kalams SA, Parker S, Jin X, et al. Safety and immunogenicity of an HIV-1 gag DNA vaccine with or without IL-12 and/or IL-15 plasmid cytokine adjuvant in healthy, HIV-1 uninfected adults. PLoS One, 2012, 7(1):e29231.

[6] Sun BH, Zhao AG. Prospective study of adverse drug reactions monitoring in patients treated with anti-tuberculosis drugs. China Med Herald, 2012, 9(19):155-156. (in Chinese)

孫碧慧, 趙安貴. 常用抗結核藥物不良反應監測前瞻性研究. 中國醫學導報, 2012, 9(19):155-156.

[7] Shu XR, Wu JJ. Multidrug-resistant tuberculosis and MDR-TB treatment progress. Tianjin Pharm, 2011, 1(23):44-46. (in Chinese)

舒向榮, 吳劍涓. 耐多藥結核病和嚴重耐多藥結核治療進展. 天津藥學, 2011, 1(23):44-46.

[8] Li R, Deng F, Fu Y, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of subcutaneous injection and intravenous infusion of recombinant human interleukin-12 and recombinant human interleukin-12 combined with hepatitis B surface antigen in cynomolgus monkeys. Pharmacology, 2010, 85(6):319-327.

[9] Fan HY, Wei J. Research progress of IL-12 antagonist in viruses infection. Med Recapitulate, 2014, 20(11):1940-1942. (in Chinese)

范懷艷, 韋嘉. 白細胞介素12在病毒感染中作用的研究進展. 醫學綜述, 2014, 20(11):1940-1942.

[10] Yang Z, Zhang Q, Xu K, et al. Combined therapy with cytokine-induced killer cells and oncolytic adenovirus expressing IL-12 induce enhanced antitumor activity in liver tumor model. PLoS One, 2012, 7(9):e44802.

[11] Xu R, Liu YM, Guo ZY. Advances in genetic polymorphisms and susceptibility to liver damage induced by antituberculosis drugs. Beijing Med J, 2012, 34(9):846-849. (in Chinese)

許瑞, 劉亞敏, 郭振勇. 基因多態性與抗結核藥物致肝損害易感性研究進展. 北京醫學, 2012, 34(9):846-849.

[12] Zhang SN, Choi IK, Huang JH, et al. Optimizing DC vaccination by combination with oncolytic adenovirus coexpressing IL-12 and GM-CSF. Mol Ther, 2011, 19(8):1558-1568.

[13] Chiu TL, Peng CW, Wang MJ. Enhanced anti-glioblastoma activity of microglia by AAV2-mediated IL-12 through TRAIL and phagocytosis in vitro. Oncol Rep, 2011, 25(5):1373-1380.

[14] Zhao H, Zhang RB. The research progress of T cells in mycobacterium tuberculosis infection. Med Recapitulate, 2010, 16(18):2740-2742. (in Chinese)

趙輝, 張榮波. T細胞在結核桿菌感染中的研究進展. 醫學綜述, 2010, 16(18):2740-2742.

[15] Xu Q, Guo L, Gu X, et al. Prevention of colorectal cancer liver metastasis by exploiting liver immunity via chitosan-TPP/ nanoparticles formulated with IL-12. Biomaterials, 2012, 33(15): 3909-3918.

[16] Yuan XL, Lei JP, Li GM, et al. Effect of different pathways and doses of inoculation on establishment of experimental tuberculosis in SD rats. J Chin Antituberculosis Assoc, 2008, 30(2):90-95, insert1-insert2. (in Chinese)

袁小亮, 雷建平, 李光明, 等. 不同感染途徑和接種菌量對建立SD大鼠結核菌感染模型的影響. 中國防癆雜志, 2008, 30(2):90-95, 插1-插2.

[17] Wang RT, Chen CM, Zhu XH, et al. Experimental research on the detection of MTB IFN-γ in vitro release by ELISA. Chin J Health Lab Technol, 2011, 21(5):1163-1164, 1166. (in Chinese)

王榮堂, 陳春梅, 朱曉華, 等. 體外釋放酶聯免疫法檢測結核桿菌γ-干擾素的實驗研究. 中國衛生檢驗雜志, 2011, 21(5):1163-1164, 1166.

[18] Zhang GM, Jia H, Hou SH, et al. Establishment of a double antibody sandwich ELISA against bovine IFN-γ and its preliminary application in clinical diagnosis of bovine tuberculosis. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica, 2014, 45(10):1693-1698. (in Chinese)

張改梅, 賈紅, 侯紹華, 等. 檢測牛IFN-γ雙抗體夾心ELISA的建立及在牛結核病診斷上的初步應用. 畜牧獸醫學報, 2014, 45(10): 1693-1698.

[19] Liu N, Su MX, Yang YH. The clinical value of T lymphocyte subsets analysis with flow cytometry in bronchoalveolar lavage fluid of patients with pulmonary tuberculosis. J Kunming Med Univ, 2016, 37(2):103-106. (in Chinese)

劉寧, 蘇明霞, 楊永輝, 等. 流式細胞檢測肺結核患者肺泡灌洗液T淋巴細胞亞群評價. 昆明醫科大學學報, 2016, 37(2):103-106.

[20] Zhou J, Xiao ZL, Tian K, et al. The value of combined detection of CRP and T-lymphocyte subsets in BALF in differential diagnosis of lung cancer and tuberculosis. Med J Natl Defending Forces Southwest China, 2014, 24(8):835-837. (in Chinese)

周菁, 肖貞良, 田坤, 等. 檢測BALF中CRP和T細胞亞群對肺結核與肺癌鑒別診斷的意義. 西南國防醫藥, 2014, 24(8):835-837.

[21] Zhang TT, Kawakami K, Tang YC, et al. Therapeutic effect of interleukin-12 on murine infection with Mycobacterium tuberculosis through modulating Th1 and Th2 cytokine balance. Chin J Tuberc Respir Dis, 2000, 23(6):358-360. (in Chinese)

張天托, 川上和義, 唐英春, 等. 白細胞介素12調節小鼠Th1/Th2的抗結核分支桿菌感染研究. 中華結核和呼吸雜志, 2000, 23(6): 358-360.

[22] Wang Y, Wang HY, Liu HL, et al.Role of cytokine IL-12 in pathogenesis of asthma in mice. Chin J Ind Med, 2015, 28(3):171-174. (in Chinese)

王袁, 王紅陽, 劉和亮, 等. 細胞因子IL-12在哮喘小鼠發病機制中的作用. 中國工業醫學雜志, 2015, 28(3):171-174.

[23] Chen J, Dong DQ, Yang YH, et al. The effect of interleukin-12 on the production of Th1 and Th2 cytokines by peripheral blood mononuclear cells from patients with tuberculosis. Chin J Tuberc Respir Dis, 2002, 25(5):292-295. (in Chinese)

陳敬, 董德瓊, 楊渝浩, 等. 白細胞介素12對結核病患者TH1/TH2平衡的影響. 中華結核和呼吸雜志, 2002, 25(5):292-295.

The effect of interleukin-12 on rat model of drug-resistant tuberculosis

LI Yu, YANG Geng

Author Affiliations: Medical Services Section (LI Yu), Laboratory (YANG Geng), People's Armed Police Hospital Engineering University, 710086 Xi’an, China

To observe and evaluate the effect of interleukin-12 (IL-12) on the changes of total bacterial count in viscera and cytokine levels of rats with resistant tuberculosis.

The 60 resistant tuberculosis animal models were made by tail vein injection of rifampin-resistant tuberculosis (106CFU/rat). The 60 rats were divided into control group (n = 30) and IL-12 group (n = 30). The rats in control group and IL-12 group were intraperitoneally injected into PBS or IL-12 treatment for 7 d. The IFN-γ levels in the plasma of rats were measured by the ELISAmethod. The subpopulations of T lymphocytes were determined by the flow cytometry. The bacteria counts were measured by the plant colony counting method, and the survival rates of rats were tested after the treatment.

In the IL-12 group, one rat was dead. In this group, the bacteria colony counts in the lung, liver and spleen were (254 ± 98) × 105, (5 ± 2) × 105, and (16 ± 4) × 105CFU/ml, respectively. The IFN-γ level of IL-12 treatment group was (1125 ± 378) pg/ml. In the control group, ten rats were died, the bacteria colony counts in the three organs were (682 ± 304) × 105, (28 ± 17) × 105, and (108 ± 35) × 105CFU/ml, respectively. The IFN-γ concentration of rats in IL-12 group was (532 ± 198) pg/ml. The significant difference was observed in both experimental groups. The results of the T lymphocytes subpopulations showed that the treatment of IL-12 significantly improved the Th1 cell-mediated immunity and adjusted the balance of Th1/Th2.

The treatment of IL-12 possesses a protective effect on rats of rifampin-resistant tuberculosis by triggering the IFN-γ production, improving the Th1 cell immunity, and changing the balance of Th1/Th2.

Interleukin-12; Extensively drug-resistant tuberculosis; Rats; Interleukin-18; Th1-Th2 balance

LI Yu, Email: baidongqwe@163.com

武警工程大學基礎研究基金（WJY201620）

李昱，Email：baidongqwe@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.011

2017-11-06