鴨瘟病毒強、弱毒株TK基因的克隆與生物信息學分析

任攀，劉情，李文文，劉亞剛

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

鴨病毒性腸炎（DVE）又名鴨瘟，鴨瘟病毒（DPV）是該病的病原，屬于皰疹病毒科（為雙股DNA），具有皰疹病毒的基本特征[1]。胸苷激酶（TK）基因是大部分皰疹病毒復制的非必需基因，是皰疹病毒的主要毒力基因之一。研究表明，TK基因具有皰疹病毒早期基因的典型特征[2]，其編碼的胸苷激酶在胸腺嘧啶合成補救途徑中是必不可少的。皰疹病毒TK基因缺失后表現出在神經細胞的復制能力明顯減弱，但其免疫原性不變，因而TK基因是皰疹病毒構建缺失疫苗的首選靶基因[3]。本研究通過對鴨瘟病毒強、弱毒株TK基因的克隆與生物信息學分析，為進一步明確DPV TK基因的功能提供了依據。

1 材料與方法

1.1 毒株和質粒 DPV AV 1221株購于中國獸醫藥品監察所，DPV雞胚化弱毒疫苗株購于廣西麗原生物股份有限公司，PMD-19T Vector購于天根生化科技有限公司。

1.2 主要試劑 DNA純化回收試劑盒、質粒小提取試劑盒、感受態細胞JM109均購于天根生化科技有限公司，Phusion High-Fidelity PCR Kit購于 New England Biolabs公司。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank上收錄的DPV基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計出特異性引物（由擎科生物公司合成），用于DPV TK基因的擴增。引物序列F1為5′-CGCGGATCCTCAC TGCGCGACTCTTGCGA，R1 為 5′-CCCAAGCTTATTA ATTGTCATCTCGGTAT。

1.4 病毒DNA提取 按照酚-氯仿-異戊醇法提取DNA，提取的DPV DNA置于-20℃保存。

1.5 TK基因的PCR擴增 以提取的DNA為模板，根據設計的特異性引物進行PCR擴增，反應體系如下：DNA 模板 2.5 μL，1μM 上下游引物各 2.5μL，5×Phusion Buffer 10 μL，10 μM dNTPs 1 μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31 μL。PCR 反應條件：98℃預變性 30 s；95℃變性 10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸35s，共30個循環；最后72℃延伸8 min，16℃保存。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，用DNA純化回收試劑盒進行回收。

1.6 TK基因的克隆及鑒定 將回收TK基因的PCR產物與載體PMD-19T連接，構建重組克隆載體，并轉化至感受態細胞JM 109，再接種于含X-gal、Amp（50mg/μL）和 IPTG 的平板上，經藍白斑篩選，挑取白色菌落接種于含Amp（50 mg/μL）的LB液體培養基中，37℃擴大培養。菌液PCR鑒定：根據質粒小提取試劑盒說明書提取質粒，重組質粒經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.7 TK基因的序列測定及生物信息學分析 將陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，同時對TK基因的核苷酸序列及其所推測氨基酸序列進行生物信息學分析。

1.8 TK基因序列的相似性分析 對本次所測的2株鴨瘟病毒TK基因序列進行BLAST分析，然后從GeneBank上下載鴨瘟病毒不同分離株的TK基因序列，然后通過Megalign程序進行相似性分析。

2 結果與分析

2.1 DPV強、弱毒株TK基因擴增 結果見圖1。圖中在約1077bp處出現特異性條帶，與預期大小符合，說明擴增成功。

圖1DPV的PCR檢測結果

2.2 DPV TK基因重組質粒鑒定 經PCR驗證為陽性的重組質粒經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，在約1077bp及2651bp位置處出現特異性條帶，與預期結果一致（圖2），表明重組克隆質粒構建成功。

2.3 DPV TK基因的生物信息學分析

2.3.1 DPV強、弱毒株TK基因同源性分析 將測序得到的兩組序列用BioXM軟件進行對比分析，得出兩片段的同源性高達100%。

2.3.2 胸苷激酶理化性質分析 預測胸苷激酶由358個氨基酸組成，理論等電點pI為6.03。

2.3.3 蛋白親水性分析 胸苷激酶的疏水性分析結果顯示：胸苷激酶為親水性蛋白，但該蛋白N端（158～162aa）有一明顯的高疏水區域。

圖2 TK基因重組質粒的鑒定結果

2.3.4 DPV胸苷激酶的二級結構及跨膜分析 分析結果顯示，胸苷激酶中α螺旋占50.28%，延伸鏈占11.45%，無規則卷曲占38.27%。根據Burhard理論推斷出該蛋白屬于混合型蛋白。胸苷激酶的跨膜區預測結果顯示，胸苷激酶的全部氨基酸均位于細胞膜外部。

2.3.5 信號肽預測 胸苷激酶的信號肽預測顯示，氨基酸的信號肽分值（S-score）均低于閾值，可以判定胸苷激酶中沒有信號肽成分，不是分泌蛋白。

2.3.6 DPV胸苷激酶的抗原表位和B淋巴細胞抗原結合表位分析 抗原表位分析結果顯示，胸苷激酶的平均抗原趨向性為1.0277，共包含有14個可能的抗原表位，其中第11位至第30位氨基酸形成的抗原表位“IRRAFSVPSMPLCLVRVYLD”具有最高的抗原指數。使用Bcepred在線工具預測胸苷激酶的B淋巴細胞抗原結合表位，結果共發現7個B細胞結合表位，見圖3。

圖3 DPV胸苷激酶的B細胞表位預測

2.3.7 TK基因序列的相似性分析 本研究中2株鴨瘟病毒的TK基因之間的相似性為100%，與GeneBank上TK基因序列的最高相似性為99.8%～100%。

3 小結與分析

本研究對DPV強、弱毒株的TK基因進行了克隆、測序，得出兩片段的同源性高達100%，通過與其他不同來源的鴨瘟病毒株進行比對，發現其同源性也達到了99.8%～100%，說明TK基因具有高度保守性。而樊振華等[4]、Kit等[5]敲除病毒的TK基因，可使毒株毒力下降，說明TK基因對病毒毒力的影響很大。鴨瘟病毒TK基因的高度保守性，意味著利用TK蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法難以用來區分野毒感染與疫苗感染，并且TK基因不是導致鴨瘟強、弱毒株致病性差異的主要因素[6]。

生物信息學是生物學領域發展最為快速的學科，具有高效、可預見性和綜合性強的優點[7]。本試驗通過對TK蛋白進行生物信息學分析，結果顯示：TK蛋白為親水性，但其中所含高疏水性區域的氨基酸主要用于穩定蛋白質的三維結構，猜測與胸苷激酶活性有關[8]；通過Burhard理論推斷TK蛋白的二級結構，認為該蛋白屬于混合型蛋白；跨膜區預測表明，DPV TK蛋白是膜外蛋白，說明TK蛋白不介導DPV對宿主細胞的吸附和轉染，同時也從側面證明了TK基因是DPV復制的非必需基因；信號肽預測得出該蛋白沒有信號肽成分，不是分泌蛋白；抗原表位分析顯示，TK蛋白具有最高的抗原指數；使用Bcepred在線工具預測胸苷激酶的B淋巴細胞抗原結合表位，共發現7個B細胞結合表位，表明TK蛋白擁有較高的抗原性。

本研究通過預測TK蛋白的性質和功能，為蛋白的表達及抗原性鑒定提供了理論支持。

[1]Plummer P J，Alefantis T，Kaplan S，et al.Detection of duck enteritis virus by polymerase chain reaction[J].Avian Disease，1998，42（3）：554-564.

[2]Gale M J，Tan S L，Katze M G.Translational control of viral gene expression in eukaryotes[J].Microbiology and Molecular Biology Review，2000，64（2）：239-280.

[3]葛菡，程安春，汪銘書，等.皰疹病毒TK基因的研究進展[J].中國獸醫科學，2008，38（1）：86-90.

[4]樊振華，孟帆，吳忻，等.豬偽狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析[J].中國畜牧獸醫，2014，41（4）：12-17.

[5]Kit S.Thymidine kinase[J].Microbiological Science，1985，12（2）：369-375.

[6]李昌主，韓先杰，鄒玲，等.鴨瘟病毒AV 1221 TK基因的克隆與序列分析[J].青島農業大學學報，2007，24（3）：162-164.

[7]宋得華，潘華奇，黎應勝，等.鴨瘟病毒TK基因及其編碼蛋白的生物信息學分析[J].安徽農業科學，2007，35（31）：9935-9936.

[8]葛菡，徐超，程安春，等.鴨瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析[J].中國獸醫科學，2008，38（4）：297-302.