耗牛沙門氏菌病診斷

陳天祥，吳毅鵬，扎巴多吉，張斌

（1.四川省若爾蓋縣農業畜牧和水務局，四川 若爾蓋 624500；2.四川省若爾蓋縣達扎寺鎮畜牧獸醫站，四川 若爾蓋 624500；3.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

牦牛沙門氏菌病也稱犢牛副傷寒，引發本病的是沙門氏菌。本病主要感染10～30日齡的犢牛，對犢牛危害較嚴重，呈流行性發生。

1 臨床癥狀和病理變化

病牛腹瀉，體溫升高達40℃，精神沉郁、呼吸困難，排含黏液的稀便，后期拒食、臥地不起，部分牦牛發病7d左右死亡。

剖檢可見患牛有出血性胃腸炎，真胃空虛，黏膜充血，腸內容物稀薄，肝、脾臟腫大，腸壁上有不易脫落的麥粒狀黃色顆粒，肺表面有壞死灶。

2 實驗室診斷

2.1 鏡檢 采取病死牦牛肝、肺革蘭氏染色，鏡檢，見兩端橢圓、不運動，不形成芽孢和莢膜的革蘭氏陰性短桿菌。

2.2 細菌分離培養 無菌采集病死牦牛的肝、肺、脾接種于普通瓊脂培養基和鮮血培養基，37℃培養24h，結果普通瓊脂培養基、鮮血平板培養基上均長出圓形，表面光滑、濕潤，周圍無溶血，邊緣整齊的小菌落。

2.3 核酸提取 分別采用酚-氯仿法和Trizol法提取5份腹瀉病料的DNA和RNA，并將RNA反轉錄成cDNA。DNA用于沙門氏菌的檢測，cDNA用于牦牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、冠狀病毒的檢測。提取完成的DNA和cDNA放于-20℃條件下備用。

2.4 PCR檢測 根據文獻引用一對沙門氏菌特異性引物進行PCR擴增，以鑒定該菌是否為沙門氏菌，擴增片段大小為498bp。另外用三對引物檢測牦牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒和冠狀病毒。PCR反應體系為：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上、下游引物（均為 10 pmol/L）各 0.5 μL，DNA模板1μL，ddH2O 3μL。PCR反應條件為：94℃預變性2min、94℃變性30s、57℃復性30s、68℃延伸1min，擴增35個循環，最后72℃延伸10min，4℃終止反應。

取5 μL擴增產物經瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀檢測與分析，凝膠成像系統顯示有3個樣本呈陽性，與陽性模板目的條帶大小一致（284 bp）。從5份腹瀉樣本中的cDNA中未檢測出牦牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒和冠狀病毒。

2.5 藥敏試驗 用常規紙片法進行藥敏試驗，所用藥片為：丁胺卡那霉素、頭孢氨噻肟、氟哌酸、奧復星、新霉素、卡那霉素、菌必治、氟苯尼考、丙氟哌酸、慶大霉素、氨芐青霉素、羅紅霉素、恩諾沙星、新生霉素、頭孢西丁。結果沙門氏菌對丁胺卡那霉素、頭孢氨噻肟、氟哌酸、奧復星、新霉素、卡那霉素、菌必治、氟苯尼考、恩諾沙星高度敏感，對丙氟哌酸、慶大霉素、氨芐青霉素中度敏感，對新生霉素、羅紅霉素、頭孢西丁低度敏感。