一種重組人溶菌酶的純化工藝研究

鄧晗，史瑾，王維，郝東，王俊，楊小琳

摘 要：目的：以畢赤酵母表達的重組人溶菌酶（hLYZ，以下簡稱hLYZ）發酵液為原料，建立一種hLYZ純化方法。方法：高速離心技術、膜過濾技術，超濾技術為主的粗純工藝；應用離子交換色譜的精細純化工藝。結果：以該純化工藝可生產獲得單一組分的hLYZ，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及反相高效液相色譜C18柱檢測其純度可達98%以上。結論：本工藝得到的hLYZ純度大于98%、可用于進一步工業化研究。

關鍵詞：hLYZ；超濾濃縮；離子交換層析；純化

中圖分類號：Q55 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）06-0176-03

Abstract： Objective： to establish a method for purification of human lysozyme （hLYZ） from the fermentation broth of recombinant human lysozyme （hLYZ） expressed by Pichia pastoris. Methods： high speed centrifugation， membrane filtration and ultrafiltration were used for crude purification， and ion exchange chromatography was used for fine purification. Results： a single component of hLYZ could be obtained by this purification process. The purity of hLYZ could reach more than 98% by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and RP-HPLC C18 column. Conclusion： the purity of hLYZ obtained by this process is more than 98%， which can be used for further industrial research.

Keywords： hLYZ； ultrafiltration concentration； ion exchange chromatography； purification

引言

溶菌酶（lysozyme）是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，又稱胞壁質酶，溶菌酶廣泛的存在于高等動物組織及分泌物、鳥類和家禽的蛋清中也含有此酶、其中以雞蛋清中含量最高[1-2]。它是一種無毒、無副作用的蛋白質，具有一定的溶菌作用，可作為食品防腐劑。同時它具有抗菌、抗病毒等多種作用[3]。溶菌酶還具有破壞細胞壁結構的功能，因此溶菌酶成為基因工程及細胞工程必不可少的工具酶[4]。隨著生物工程的迅速發展，溶菌酶應用價值將會越來越重要。目前用于溶菌酶分離純化的方法主要有結晶法[5-6]、離子交換法[7-8]，特別是現在采用的新技術如膜分離技術[9-10]、超濾法、親和-膜過濾技術等[11-12]。

與其他來源溶菌酶相比，人溶菌酶具有其優越性和多種藥理作用，在臨床上也具有重要價值。 因此分離純化得到高純度hLYZ，產品用于進一步科學研究就顯得尤為重要。但天然溶菌酶來源及其困難，DNA重組技術進行生產是解決這一困難的有效途徑，現已利用化學合成或從人細胞組織中制備cDNA等途徑獲取人溶菌酶基因，并在大腸桿菌，酵母菌等表達系統進行了表達，由于其表達水平不高，再加上后期純化工藝損失，總體收益較低， 因此目前國內外對于hLYZ純化工藝研究相對較少，本工藝運用固液分離技術，超濾技術、離子交換層析技術得到純度大于98%的hLYZ產品，符合工業化生產要求，且工藝相對簡單易操，可用于進一步的工業化研究。

1 材料和方法

1.1 儀器

遼陽陽光三足式離心機（SSC600-NG）、0.22um除菌濾器、天津膜天膜中空纖維膜組件、武漢新力協力超濾膜組件、AKTA purifiers 100、北京六一電泳儀、日立HPLC 、C18層析柱（中科院大連化學物理研究所）。

1.2 試劑及材料

（1）試劑。十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸以及電泳相關試劑均為國產分析純；去離子水；超純水；乙腈及三氟乙酸均為色譜純；CM Sepharose Fast Flow（保賽恒成生產，批號：20131120）。對照品LYZ：sigma Lysozme hunman（L1667）。（2）材料。本公司201705003-50L批hLYZ發酵液。

1.3 方法

（1）hLYZ粗純。發酵液經沉降式離心機轉速2000轉/分鐘，離心60分鐘進行固液分離；收集上清，上清經0.22um中空纖維膜過濾系統，去除殘余菌體、細胞碎片以及部分雜質；收集0.22um濾出液用5k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽。（2）hLYZ陽離子交換層析。a. 樣品處理：最終收集收集的濃縮液中加入0.05M磷酸二氫鈉溶液，調節pH7.5-8.0，電導6.0-7.0 mS/cm，配成上樣溶液備用。b. CM陽離子交換層析純化：配制流動相A：pH7.6 50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5-8.0之間，電導6.0-7.0 mS/cm；B：pH7.6 50mM磷酸鹽緩沖液，1M NaCl，pH7.5-8.0之間。將a中的hLYZ樣品上CM FF層析柱，樣品上樣完成后，用A相平衡，10%B相洗脫為雜質，16%B洗脫液為hLYZ。

1.4 分析檢測

（1） Tricine-SDS-PAGE電泳檢測。hLYZ分子量為14.7Kd，故采用15%的分離膠分別對粗純樣品以及離子交換層析樣品進行分析檢測，先60v電壓 60min，再120v電壓150min。電泳完成后用固定液固定30min，再用R250染色30min，最后用脫色液脫色。（2）HPLC對hLYZ純度分析。采用HPLC對純化后hLYZ進行純度分析，色譜柱為C18柱，流動相A：生理鹽水+0.1%TFA；B相為60%已腈+40%生理鹽水，色譜分析程序為40B-70B 30min。檢測波長為215nm。

2 結果

2.1 hLYZ純化

hLYZ發酵液先進行固液分離；去除酵母細胞以及不溶性雜質，在過0.22um中空纖維膜過濾系統，進一步去除殘余菌體、細胞碎片以及部分大分子物質等；最后用5k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽出去部分小分析物質。

將5k脫鹽濃縮后的hLYZ加入0.05M磷酸二氫鈉溶液，調節pH7.5-8.0，電導6.0-7.0 mS/cm，分別用10%，16%的B相進行階梯洗脫，16B洗脫為目標蛋白，見圖1。

2.2 Tricine-SDS-PAGE電泳檢測

對分離純化得到的hLYZ采用Tricine-SDS-PAGE電泳分分析檢測其純度，檢測結果如圖2所示，分離得到的hLYZ分子量在14.4kd，與對照品LYZ電泳遷移位置一致，且整個電泳條帶中雜帶較少，純度較高。

1：蛋白分子量標準；2：對照品LYZ；3：純化后hLYZ

2.3.HPLC純度分析

經高效液相色譜分析表明：純化后hLYZ出峰時間為16.03min，對照品hLYZ出峰時間為15.96min。純化后hLYZ與對照品hLYZ出峰時間基本一致，采用面積歸依法計算峰面積，得到hLYZ產品純度98.3%，hLYZ產品檢測色譜圖如圖3 ，hLYZ對照品出峰時間如圖4。

3.結束語

本方法采用傳統的固液分離技術、過濾技術以及超濾技術得到hLYZ粗品，經一部陽離子交換層析得到純度位98.3%的hLYZ產品。目前國內外對于hLYZ的研究較少，且大部分集中在對蛋清等其他來源的溶菌酶的研究，而對人溶菌酶的研究相對較少，分離純化方面的研究鮮有報道，本工作初步建立了一種以超濾過濾技術粗純，陽離子交換層析技術精純的hLYZ高純度分離純化工藝，工藝進一步優化后，有望進行高純度大規模的生產。

參考文獻：

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