絞股藍總皂苷對糖尿病腎病大鼠腎皮質基因表達譜的影響研究

郎志芳 王洪偉 李姝 劉蘭濤

[摘要] 目的 探討絞股藍總皂苷對糖尿病腎病大鼠皮質基因表達譜的影響。 方法 選取30只大鼠為實驗樣本，制作20只DN模型后分為對照組和觀察組，對照組為DN大鼠參考組，觀察組DN大鼠則應用絞股藍總皂苷進行治療，對比兩組DN大鼠腎皮質基因表達譜差異。 結果 觀察組大鼠與對照組大鼠腎皮質基因表達上存在差異，差異基因132條，其中31條上調基因，133條下調基因。 結論 絞股藍總皂苷對糖尿病腎病大鼠皮質基因表達譜有明顯影響，可改變其基因表達，改善其糖尿病癥狀和免疫機能。

[關鍵詞] 絞股藍總皂苷；糖尿病腎?。荒I皮質基因表達

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-4062（2018）11（a）-0169-02

糖尿病腎病是常見的糖尿病并發癥之一，也是糖尿病患者晚期常見的致死性并發癥。截止到目前為止，尚未在研究中明確糖尿病腎病的發病機制，通常認為與糖代謝異常、高血壓、腎組織血管活性物質、機體生長因子、機體化學趨化因子、遺傳等因素有關。絞股藍總皂苷是一種提取自葫蘆科植物絞股藍的活性物質，具有良好的抗高血脂、抗動脈中樣硬化、降血糖、抗腫瘤、清除氧自由基等功效，有學者指出絞股藍總皂苷可有效降低糖尿病腎病小鼠血糖，改善糖尿病小鼠腎功能，因此為探究絞股藍總皂苷對DN大鼠腎皮質基因表達譜的影響，展開該次研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 模型鼠制備及分組

共選取30只大鼠進行實驗，均為正常環境下培育。其中20只切除所有大鼠單側腎后行STZ注射制作改良DN大鼠模型，隨機分為對照組和觀察組，每組10只。另外10只實驗用大鼠不做特殊處理，作為正常參考組。

對照組10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg生理鹽灌胃，觀察組10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg絞股藍總皂苷灌胃，參考組10只正常大鼠每日使用0.5g/kg生理鹽進行灌胃，灌胃1次/d，連續灌胃4周，于4周后對比3組大鼠腎皮質基因表達譜變化。同時納入實驗大鼠均為單籠飼養，進水、進食為過剩補給，有大鼠自主選擇進食和進水時機。

1.2 實驗及標記方法

使用“一步法”抽提觀察組大鼠腎皮質總RNA，采用Oligotex mRNA Midi Kit純化mRNA，利用反轉錄標記cDNA探針并純化。直接標記大鼠cDNA，其中對照組大鼠RNA使用Cy3熒光標記，觀察組大鼠RNA使用Cy5熒光標記。

1.3 雜交與洗滌

基因芯片（來源于上海博興基因芯片有限公司）和雜交探針分別置于95℃水中，水浴5 min使之變性，并將探針加在基因芯片上，蓋玻片封片后將基因芯片置于60℃水中雜交，持續15～17 h，雜交完成后揭開蓋玻片，并使用2*SSC+02%*SDS、0.1%SSC+0.2%SDS、0.1%SSC洗滌，分別洗滌10 min，室溫下晾干待檢。

1.4 檢測與分析方法

使用激光共聚焦掃描儀獲取16-bit tiff圖像文件，使用ImaGene3.0軟件分析對照組Cy3熒光標記信號以及觀察組Cy5熒光信號強度變化和比值。通常以Ratio值在0.5～2.0之間為基因表達不存在顯著差異，此范圍之外為基因表達發生顯著改變，差異篩選標準Ratio為Cy5/Cy3，當Ratio>2.0表示基因上調，<0.5則提示基因下調。

2 結果

2.1 檢測指標對比

預定實驗周期4周，即于第28天測定3組大鼠的血糖、尿蛋白、血肌酐水平，結果表明對照組和觀察組大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白均高于正常參考組，同時觀察組大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），這提示絞股藍總皂苷可有效降低DN大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平。見表1。

2.2 基因芯片掃描結果

對處理好的基因芯片進行掃描，獲得圖像后將觀察組和對照組大鼠圖像進行疊加后掃描，結果顯示Cy3與Cy5熒光標記信息獲取數量越多時兩者間差異越大，這提示對照組大鼠和觀察組大鼠腎皮質基因表達譜在局部具有相似性，整體上仍存在較大差異。

2.3 差異表達基因篩選結果

對2.2中的結果進行深度分析后，發現在腎皮質基因表達譜上觀察組和對照組共存在132條差異表達基因，根據預定Ratio值進行劃分，其中133條下調基因，31條上調基因。其中可以明確的下調基因有糖基化終末受體基因、唾液酸轉移酶基因、涎酸轉移酶基因、胰高血糖素受體基因、腎小球系膜區細胞外基質聚集相關基因等，其中以胰高血糖素受體基因下調最明顯，可以明確的上調基因有絲氨酸蛋白抑制劑2b基因。見表2。

3 討論

有研究指出糖尿病腎病形成和發展與晚期糖基化終末產物有較大聯系，其與機體內多種蛋白質都可發生非酶糖基化變化，使其結構、強度、溶解性、配位、交聯性質發生改變，從而誘發糖尿病腎病，因此也有學者認為晚期糖基化終末產物是糖尿病腎病發病的致病因子。當然糖尿病腎病的發生和對腎皮質基因表達譜的影響不僅僅局限于bank編號為NM-053336的晚期糖基化終末產物受體（RAGES），還對文中前述唾液酸轉移酶基因、涎酸轉移酶基因、胰高血糖素受體基因、腎小球系膜區細胞外基質聚集相關基因等基因表達有影響，但其中以糖基化終末受體最為典型，這與RAGES自身特點有密切聯系。

蛋白質的糖基化具有明顯的組織特異性，在發育過程中受糖基轉化酶活性的影響，其中唾液酸轉移酶與涎酸轉移酶的活性增加后會增加糖基化終末產物的產量。而糖基化終末產物（AGEs）可通過直接或間接兩種途徑對腎臟造成損傷。其直接作用如下，通過炎細胞介導造成基質擴張和腎小球硬化，引起腎小球基底膜支架結構孔徑增大、通透性升高而引起蛋白尿，但此種直接損傷的程度相對有限，常見的損傷機制仍以間接為主，即通過與受體結合來釋放多種有害因子累及腎臟，使腎臟肥大、腎小球硬化、間質纖維化等，因此從某種意義上來說抑制糖基化終末受體的產生可有效阻斷AGEs對腎臟的損傷，從而保護糖尿病機體的腎臟功能。

在該組研究中，用于治療DN大鼠的絞股藍皂苷是一種提取自葫蘆科植物絞股藍的活性物質，以灌胃的方式應用與實驗，發現應用后DN大鼠腎皮質基因表達譜發生改變，其中主要的幾項與糖尿病腎病形成和發展的基因均下調，這提示絞股藍總皂苷具有明確延緩DN病理進程的功效，因此具有臨床應用的潛力。當然高血糖仍是糖尿病腎病發生的始動因素，應用絞股藍只是能夠有效延緩病情進展，想要完全治愈DN仍需要長期的降糖治療。

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（收稿日期：2018-08-05）