凡口鉛鋅礦廢棄地植物內(nèi)生細菌抗Pb、Zn菌株的篩選及16S rDNA鑒定

曾松榮，莊雪晴，鄭秋樺，張翠瓊，郭偉敏

（韶關(guān)學院 英東生命科學學院，廣東 韶關(guān)512005）

隨著科學技術(shù)的發(fā)展和工業(yè)化進程的加快，采礦工業(yè)和冶金工業(yè)在帶動經(jīng)濟發(fā)展的同時也造成了土壤重金屬污染日益嚴重.重金屬污染不僅影響土壤微生物和植物的生長發(fā)育，而且由于重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中的高流動性，使其極易通過農(nóng)產(chǎn)品或受污染的水進入食物鏈，進而危及人類健康［1-2］.這些重金屬離子在土壤中不能被降解，并且有一定的毒害作用.因此土壤重金屬污染的治理已經(jīng)成為人們亟待解決的問題之一.

目前，國內(nèi)外對土壤重金屬污染的治理方法主要包括物理修復法、化學修復法、農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)修復法和生物修復法等［3］，其中物理或化學修復法在治理過程不僅具有能耗大、成本高、難以大規(guī)模實行修復等缺點，而且還可能對土壤造成二次污染.近年來，生物修復作為一種新型的土壤重金屬污染修復技術(shù)具有巨大的應(yīng)用前景.生物修復方式主要包括植物修復和微生物修復.植物修復法是利用植物對重金屬的吸收作用，通過在污染地區(qū)種植植物，使金屬離子在植物中富集而移除.該方法具有綠色環(huán)保、低成本等優(yōu)點［4-5］，但是由于礦區(qū)植物類群簡單，且植物根系擴張有限，使植物修復受到限制.已有研究發(fā)現(xiàn)一些根際微生物對重金屬有較高的抗性，并且對某些重金屬具有一定的吸附能力，但微生物個體微小，對重金屬的吸附能力有限且難以移出土壤，微生物修復也存在一定局限性.植物-微生物聯(lián)合修復可將植物和微生物的優(yōu)勢結(jié)合起來，不僅不會造成土壤二次污染，還能對污染的土壤進行大范圍修復，達到更好的修復效果，在提高植物對土壤重金屬的吸收和轉(zhuǎn)化效率方面具有巨大的應(yīng)用潛力［6-10］.

粵北凡口鉛鋅礦位于廣東省仁化縣，是中國主要的鉛鋅礦產(chǎn)地之一.凡口鉛鋅礦于1958年建礦，已有50多年歷史，隨著技術(shù)的發(fā)展，年產(chǎn)量逐年增長，礦區(qū)廢棄地的生態(tài)修復方面也做了大量工作并取得了一定的成效，重金屬污染治理得到了明顯改善.本實驗以粵北凡口鉛鋅礦廢棄地的尾礦庫和廢石堆優(yōu)勢植物的內(nèi)生細菌為研究對象，通過采集優(yōu)勢植物水燭、狗牙根、節(jié)節(jié)草、類蘆、醉魚草、蜈蚣草等六種植物作為實驗材料，分離這些優(yōu)勢植物根部的內(nèi)生細菌并篩選抗鉛、鋅重金屬離子能力較強的抗性菌株，并通過16S rDNA分子生物學鑒定初步確定其種屬關(guān)系，為探索內(nèi)生細菌提高宿主植物重金屬耐受性以及對宿主植物促生作用的機理和礦區(qū)廢棄地的植被恢復提供一定的理論依據(jù)［11-13］.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物

采集廣東省仁化縣凡口鉛鋅礦廢棄地的尾礦庫和廢石堆優(yōu)勢植物水燭（Typha angustifolia）、狗牙根（Cynodon dactylon）、節(jié)節(jié) 草（Equisetum ramosissimum）、類 蘆（Neyraudia reynaudiana）、醉魚 草（Buddleja lindleyana）、蜈蚣草（Pteris vittata）等六種植物做為實驗材料.

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20min，液體培養(yǎng)基中無瓊脂粉.

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20min，液體培養(yǎng)基中無瓊脂粉.

1.1.3 藥品及試劑

制霉菌素、氨芐青霉素、高保真PCR擴增預混液試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、San Prep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker、細菌16S通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）、M13 測序引物（Premix 1：5'-GTAAAACGACGGGT-3'，Premix 2：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'）等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司.Pb(NO3)2、ZnSO4·7H2O 等試劑均為分析純，產(chǎn)自天津大茂市化學試劑廠.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

將上述采集到的6種新鮮植株的根在自來水下沖洗干凈并瀝干水分，將洗凈的植物根段剪成約為2～4 cm的片段，然后在超凈工作臺中置于75%的酒精中浸泡2 min后，再將根段置于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5 min，再用無菌水沖洗3～5次，并分別保留最后一次沖洗的無菌水涂布平板以檢驗其根段表面是否殺菌徹底.將經(jīng)過表面消毒的根段和少量的無菌水放入研缽中充分研磨，將研磨液做10-2、10-3、10-4、10-5 的梯度稀釋備用［10］.

1.2.2 優(yōu)勢植物內(nèi)生細菌的分離純化

用移液槍分別吸取上述制備好的不同濃度梯度的稀釋液及最后一次清洗植物根段的無菌水各100 μL，在含制霉菌素的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中進行涂布，每個濃度梯度的稀釋液涂兩個平板，37℃條件下倒置培養(yǎng)2～3 d.挑取形狀、大小、顏色等特征不同的菌落進行平板劃線，分離純化直至得到單菌落，記錄各菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌體個體形態(tài).

1.2.3 耐重金屬離子優(yōu)勢菌株的篩選

以Pb(NO3)2和 ZnSO4·7H2O作為Pb2+和Zn2+的添加劑，初步設(shè)定金屬離子濃度梯度為650 mg/L，750 mg/L，850 mg/L，950 mg/L，1 050 mg/L，于超凈工作臺中用0.22 μL濾膜過濾得到無菌的金屬離子溶液.分別制備含有不同濃度的Pb2+或Zn2+的LB固體培養(yǎng)基，通過涂布平板法進行篩選，每個試驗重復兩次；若平板長出菌落則提高相應(yīng)的金屬離子濃度，若平板無菌落形成則降低相應(yīng)的金屬離子濃度.通過不斷調(diào)整兩種金屬離子濃度，篩選出對Pb2+和Zn2+耐受性較強的內(nèi)生細菌.

1.2.4 抗重金屬內(nèi)生細菌的16S rDNA序列鑒定

1.2.4.1 基因組DNA的提取

將篩選得到的內(nèi)生細菌進行搖瓶過夜培養(yǎng)使其活化.取1.5 mL活化的菌懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，12 000 rpm離心1 min.棄上清，沉淀中加入50 μL STES緩沖液重懸細胞；向細胞懸液中添加適量酸洗過的玻璃珠和20 μL TE緩沖液，再加入60 μL Tris-飽和酚：氯仿溶液.在微型渦旋混合儀上震蕩約10 min，使菌體裂解；于12 000 rpm離心5 min，將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積3 mol/L的醋酸鈉溶液；12 000 rpm離心10 min，棄上清，保留沉淀；室溫晾2～3 min，使乙醇完全揮發(fā)，加入40 μL的TE緩沖液使DNA完全溶解，電泳鑒定后，置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.4.2 基因組DNA的PCR擴增

以提取的基因組作為模板進行 PCR，PCR反應(yīng)體系為：1 μL基因組 DNA、1 μL 27F引物、1 μL 1492R、25 μL高保真PCR擴增預混液，補加Sterilized dd H2O至總反應(yīng)體積為50 μL，PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 2 min，29個循環(huán)，72℃ 5 min.對擴增 PCR 產(chǎn)物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，對PCR產(chǎn)物回收.

1.2.4.3 PCR純化產(chǎn)物末端加A

將純化的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)管中，加入等體積的Premix TaqTM酶混勻，于72℃ PCR儀上反應(yīng)45 min加A，然后回收鑒定.

1.2.4.4 根內(nèi)生細菌16S rDNA的體外重組與轉(zhuǎn)化

將3′末端加A的PCR產(chǎn)物，連接到pUCm-T克隆載體上，然后采用氯化鈣化轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，挑選轉(zhuǎn)化子，以菌液PCR進行鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，菌液PCR反應(yīng)體系為：1 μL大腸桿菌菌液，1 μL Premix 1，1 μL Premix 2，25 μL 高保真 PCR 擴增預混液，補加 Sterilized dd H2O 至總反應(yīng)體積為 50 μL，PCR 反應(yīng)條件為 94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 2 min，29 個循環(huán)，72℃ 5 min. 對擴增PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定.

1.2.4.5 測序與比對

對每個菌株測序獲得的16S rDNA與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，選取相似度高的同源序列.利用MEGA 5.0軟件，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以初步確定內(nèi)生細菌的種屬關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離

六種植物根部分離純化共得到72株內(nèi)生細菌.用最后一次清洗植物根段的無菌水涂布的培養(yǎng)基上均沒有菌落生長，說明植物根段表面已經(jīng)殺菌徹底，分離得到的細菌都是根部內(nèi)生細菌.

2.2 抗重金屬內(nèi)生細菌的篩選

從六種植物中篩選得到的抗重金屬離子Pb2+和Zn2+能力強的菌株共24株，其中節(jié)節(jié)草2株、類蘆2株、水燭5株、狗牙根4株、醉魚草5株、蜈蚣草6株，如表1所示.

表1 內(nèi)生細菌對Pb2+和Zn2+的耐受性

結(jié)果表明，篩選出來的24株植物根部內(nèi)生細菌中對Pb2+的耐受性均大于850 mg/L，而對Zn2+的耐受性在100～750 mg/L的范圍內(nèi)不等.

2.3 抗重金屬內(nèi)生細菌的分子生物學鑒定

鑒定的24株內(nèi)生細菌基因的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在大約1 500 bp的位置都有一明顯條帶，其中SZ-3、SZ-5、ZY-2、ZY-9基因組PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的重組受體菌在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長情況良好，如圖2所示.

圖1 部分抗性菌株基因組PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的重組受體菌平板生長情況

將篩選得到的重金屬抗性比較強的24個菌株進行16S rDNA分子生物學鑒定，每個菌株的測序結(jié)果為兩條堿基序列，通過DNAMAN和BioEdit軟件進行拼接處理，均得到一段大小約為1 500 bp的序列.將拼接好的序列提交到NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫，通過BLAST比對，查找同源序列，利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖3至圖7所示，圖中分支上的數(shù)字表示樹形可信度，括號內(nèi)為NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號.

圖3 節(jié)節(jié)草和類蘆中抗性較高的內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 水燭中抗性較高的內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 狗牙根中抗性較高的內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 醉魚草中抗性較高的內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 蜈蚣草中抗性較高的內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)果表明，分離得到的24個菌株中有23株與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為同一個分支.其中，菌株JJ-4、JJ-8、LL-12、SZ-7、GY-7、GY-10、GY-11、GY-12、ZY-2、ZY-5、ZY-7、ZY-8、WG-7、WG-10 均與 Bacillus cereus的親緣性較近；菌株LL-9與Bacillus subtilis(NR 102783.1)的親緣性較近；菌株SZ-2、SZ-3與Bacillus amyloliquefaciens（NR 075005.1）聚為同一個分支，SZ-8、WG-4、WG-9、WG-11、WG-13 與 Bacillus firmus（NR 025842.1）聚為同一個分支；ZY-9 與 Bacillus amyloliquefaciens（NR 075005.1）聚為同一分支；而菌株SZ-5的16S rDNA序列與Aneurinibacillus aneurinilyticus（NR 112203.1)相似性為100%，鑒定為解硫胺溶硫胺素芽孢桿菌.

3 結(jié)論

植物內(nèi)生菌的分離鑒定是研究植物和微生物共生的基礎(chǔ)，也是研究植物和微生物之間互作的前提.本實驗所用實驗材料為凡口鉛鋅礦廢棄地的尾礦庫和廢石堆中采集到的六種優(yōu)勢植物，從中分離純化共得到72株根部內(nèi)生細菌，并對其進行Pb2+、Zn2+重金屬抗性篩選，得到的24株耐受性較高的菌株.對該24株內(nèi)生細菌進行16S rDNA分子生物學鑒定，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定結(jié)果SZ-5菌株為解硫胺溶硫胺素芽孢桿菌（Aneurinibacillus aneurinilyticus），其余23株都屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）.本實驗分離篩選得到的抗性菌株為進一步探索內(nèi)生細菌對重金屬礦區(qū)宿主植物的促生作用機理研究以及礦區(qū)廢棄地的植物-微生物聯(lián)合修復等實踐工作奠定了一定的基礎(chǔ).