探討PD-1和PD-L1蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義

侍孝紅

南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院病理科，江蘇宿遷 223800

胃癌屬于消化系統惡性腫瘤，大部分患者就診時已發展為中晚期，整體生活質量差且生存時間較短，死亡率占癌癥死亡的第四位。胃癌的致癌作用為一個復雜的過程，有致癌基因的激活、抑癌基本的失活等多步驟、多基因參與[1-2]。免疫逃逸在腫瘤的發生與進展過程中起到重要作用，腫瘤抗原特異性T細胞的無反應性和誘導凋亡為其主要機制。PD-1和PD-L1蛋白是機體免疫系統中的抑制性通路，其對調節生理性免疫應答的幅度、持續時間以及維持免疫耐受發揮重要作用，效防止免疫應答破壞、損傷正常組織[3-4]。該研究選擇2014年6月—2018年8月在該院行胃癌根治術的胃癌患者的石蠟標本66例與腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織60例，旨在分析PD-1和PD-L1蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義。具體信息如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇在該院行胃癌根治術的胃癌患者的石蠟標本66例為觀察組，并隨機選取腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織60例為對照組。66例患者中男49例，女17例；年齡25～84歲；平均年齡（58.67±2.34）歲。入組患者或家屬均簽署知情同意書。該研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

對PD-1和PD-L1蛋白表達采用免疫組織化學PV-6000二步法進行檢測，嚴格參照試劑盒說明書實施操作。將標本蠟塊連續切為4 μm厚度的切片，脫蠟、水化后，加入3%過氧化氫溶液，室溫下作用10 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min，共3遍。完成后，將檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）置入，加熱 20 min（微波爐），修復抗原，冷卻至室溫溫度。PBS液沖洗5 min，共3遍。將兔抗人PD-L1多克隆抗體（1：200 稀釋鼠）與鼠抗人 PD-1 單克隆抗體（1：200稀釋）滴入，4℃孵育過夜。PBS液沖洗5 min，共3遍。分別將50 μL二抗滴加在每張切片上，室溫下孵育20 min。PBS液沖洗5 min，共3遍。在每張切片上滴加100 μL DAB顯色劑（新鮮配置），閉光顯色于室溫下。光學顯微鏡下控制顯色時間，5 min后使用蒸餾水將切片沖洗干凈，使顯色終止。加蘇木精復染1 min，自來水沖洗返藍，經梯度乙醇對切片脫水，完成后行10 min二甲苯透明，中性樹膠封固。

表1 PD-1和PD-L1在胃癌組織中的表達比較[n（%）]

1.3 結果判定

PD-1和PD-L1以細胞質或細胞膜有黃-棕褐色顆粒出現為陽性顯色。PD-L1表達使用染色強度、半定量積分法結合陽性細胞百分比評估。對切片整個視野在低倍鏡下觀察，在腫瘤細胞、間質上各選擇5個×400高倍視野。染色強度分級：無著色為0分，淡黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分。陽性細胞密度分級：陽性細胞數≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。陽性細胞密度與染色強度得分相乘即為陽性表達結果。腫瘤細胞、間一項結果為陽性，則該樣本為陽性表達。D-1陽性結果以細胞計數法實時評估。對切片整個視野在低倍鏡下觀察，對淋巴細胞密度較高位置進行查找，隨機選擇5個高倍視野（×400），各計數100個淋巴細胞中PD-1陽性細胞數，PD-1陽性細胞數取均值。以閾值為PD-1陽性細胞數，細胞數高于閾值為陽性表達，反之，則為陰性表達。

1.4 觀察指標

比較PD-1和PD-L1在胃癌組織與癌旁組織中的表達情況。分析胃癌組織中PD-1和PD-L1表達與臨床病理因素的關系，其包括性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、浸潤層面、脈管癌栓、淋巴結轉移、pTNM分期等。

1.5 統計方法

使用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，以[n（%）]表示計數資料，χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-1和PD-L1表達情況

PD-L1蛋白在胃癌組織中陽性表達率為66.67%（44/66），癌間質淋巴細胞與癌細胞上表達陽性率分別為33.33%（22/66）、65.15%（43/66）。 PD-1蛋白表達陽性腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）數量為 0～50（14.91±4.51）個，閾值為14.91，陽性率為 40.91%（27/66）。觀察組中 PD-1和 PD-L1在胃癌組織中陽性表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1、圖 1～9。

圖1 胃癌組織中PD-L1陽性

圖4 間質中PD-L1陽性

圖5 間質中PD-L1陰性

圖6 空白對照

圖7 胃癌組織中PD-1陽性

圖8 胃癌組織中PD-1陰性

圖9 空白對照

2.2 PD-1和PD-L1在胃癌組織中表達與臨床病理因素關系

PD-L1在胃癌間質中表達與淋巴結轉移有關；PD-L1在胃癌細胞中表達與pTNM分期、脈管癌栓、浸潤層面、淋巴結轉移有關（P＜0.05）；胃癌組織中PD-1表達與患者各臨床病理因素無關（P＞0.05）。 見表2。

表2 PD-1和PD-L1表達與胃癌患者臨床病理因素的關系分析

3 討論

PD-1/PD-L1免疫檢查點傳遞抑制性信號，可對T細胞的活化起到抑制作用，而造成腫瘤免疫耐受，可誘導T細胞活化并將腫瘤細胞殺傷[5-6]。PD-1屬于階段抑制T細胞免疫檢查點，可經多種基因使CD25+調節性T（Treg）細胞產生并維持，抑制效應性T細胞功能；可有效增強Treg細胞的活性，促進惡性腫瘤發展；致使PD-L1、2表達細胞的免疫耐受[7-9]。PD-L1屬于Ⅰ型穿膜蛋白，其只有在細胞膜上表達才能發揮生物學活性，可激活致癌基因和改變IFN-γ表達以達到其生物效應。PD-L1在癌細胞中表達上升可起到促使浸潤、轉移的作用，避免CD8+T細胞攻擊腫瘤細胞，逃逸機體的免疫監視系統；可使T細胞的存活與增殖減少，對腫瘤惡化與進展起到促進作用[10-11]。PD-L1可經結合B細胞上PD-1，使信號分子Syk、Igα/β發生去磷酸化，傳遞免疫抑制信號，避免腫瘤受殺傷系統損害和免疫監視。

李毓飛等[12]研究顯示，癌組織中PD-1、PD-L1陽性表達率分別為 46.67%（35/75）、37.33%（28/75）， 癌旁組織中PD-1、PD-L1 陽性表達率分別為 25.33%（19/75）、10.67%（8/75）。該研究結果顯示，觀察組中PD-1和PD-L1陽性表達率分別為 66.67%（44/66）、40.91%（27/66）， 對照組中無PD-1和PD-L1蛋白表達，這與上述研究結果一致，癌組織中PD-1、PD-L1表達明顯高于癌旁組織。但兩者陽性率存在明顯差異，這可能與兩者試劑克隆號不同、檢查方式不同等有關。癌間質淋巴細胞PD-L1陽性率略高于癌細胞，可能與癌細胞PD-L1表達誘導周圍淋巴細胞凋亡或抑制其浸潤所致。癌間質中PD-L1表達與淋巴結轉移有關；癌細胞中PD-L1表達與浸潤層面、脈管癌栓、淋巴結轉移、pTNM分期有關。提示PD-L1可經影響腫瘤微環境、調節免疫，促進腫瘤轉移與浸潤；腫瘤切除后PD-1和PD-L1仍有可能在殘余淋巴結中表達，容易繼續影響原發病灶周圍微環境的抗腫瘤免疫，導致患者術后生存期縮短。PD-1與PD-L結合，經引起失活效應T細胞核T細胞凋亡，對抗腫瘤免疫起到抑制作用。PD-L1在腫瘤微環境中負向調節免疫反應與腫瘤細胞中的上調，說明阻斷PD-1/PD-L信號通路，可能成為胃癌免疫治療的新策略。

綜上所述，PD-1和PD-L1蛋白在胃癌組織中表達顯著升高，而PD-L1與患者臨床病理特征關系密切，可將其作為胃癌治療的新靶點。