胚胎停育和人流后組織中基因變化分析

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【摘 要】目的：通過(guò)運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)研究染色體異常所導(dǎo)致的流產(chǎn)遺傳機(jī)制，并探尋胚胎停止發(fā)育和絨毛組織中染色體發(fā)生異常的相關(guān)危險(xiǎn)因素，有利于科學(xué)的干預(yù)、指導(dǎo)育齡期女性出現(xiàn)胚胎停止發(fā)育的現(xiàn)象。方法：采集發(fā)生胚胎停育的94名患者的流產(chǎn)后絨毛組織（2017年5月至2018年5月，山東省東營(yíng)市勝利石油管理局勝利醫(yī)院婦科），標(biāo)本培養(yǎng)后運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)染色體進(jìn)行核型分析。結(jié)果：收集標(biāo)本全部培養(yǎng)成功，檢測(cè)結(jié)果中染色體結(jié)構(gòu)異常5例；染色體數(shù)目異常37例；異常核型49例。結(jié)論：染色體異常是導(dǎo)致胚胎停育的重要原因。及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育有重大意義。

【關(guān)鍵詞】胚胎停育；絨毛組織；高通量測(cè)序

【中圖分類號(hào)】R394.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）23--01

高通量測(cè)序（High-Throughput Sequencing）又稱下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測(cè)序（Sanger Sequencing）而言的。高通量測(cè)序技術(shù)具有高解析度、高輸出量的特性，極大的減少了測(cè)序的費(fèi)用和時(shí)間，發(fā)現(xiàn)核型分析技術(shù)檢測(cè)不到的CNV。作為疾病的一項(xiàng)生物學(xué)標(biāo)志，染色體的擴(kuò)增和缺失等變化，已經(jīng)成為許多疾病的研究熱點(diǎn)。異常DNA拷貝數(shù)變異（CNV，Copy number variations）是導(dǎo)致人類許多疾病（遺傳性疾病、癌癥等）的重要分子機(jī)制。致病性的CNV可以導(dǎo)致胚胎停育，如果發(fā)現(xiàn)該類CNV，即可告知孕婦（自然受孕很難得到健康的孩子）需要進(jìn)行輔助生殖技術(shù)受孕，對(duì)實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有極其重大的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取發(fā)生胚胎停育的94名患者（2017年5月至2018年5月，山東省東營(yíng)市勝利石油管理局勝利醫(yī)院婦科），經(jīng)手術(shù)清宮或藥物流產(chǎn)后，收集的94例絨毛組織標(biāo)本作為研究對(duì)象。采集標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡：23-43歲（其中高齡孕婦16人，試管嬰兒5人）；孕周：6-10周（均為單胎妊娠）。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者對(duì)本組研究完全知情同意，均明確為胚胎停育；超聲檢查無(wú)原始血管波動(dòng)，無(wú)胚芽[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染因素患者；家族遺傳史；免疫功能異常；凝血機(jī)制障礙[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 采集樣本情況：患者均因胚胎停育行清宮術(shù)或藥物流產(chǎn)終止妊娠，終止妊娠后采集標(biāo)本量不低于10mg的絨毛組織。

1.2.2 母體污染觀察：將絨毛用生理鹽水反復(fù)沖洗5-10次，沖洗（母血及污染物）干凈直至沒(méi)有明顯紅色血樣污染物為止。

1.2.3 樣本保存溫度為冷凍狀態(tài)，運(yùn)輸條件為低溫運(yùn)輸。

1.2.4 DNA降解情況需要注意，采集樣本后需要盡快冷凍運(yùn)輸，避免時(shí)間間隔過(guò)長(zhǎng)，發(fā)生DNA降解。

觀察并記錄培養(yǎng)成功的標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)本的絨毛細(xì)胞核型，根據(jù)絨毛標(biāo)本是否存在異常核型來(lái)進(jìn)行分組，并用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)分析胚胎停育的染色體異常類型及常見絨毛組織的異常核型的差異。高通量測(cè)序：收集新鮮冷凍的流產(chǎn)組織物，取絨毛組織10mg（不少于10mg），從中提取基因組DNA。（1）基因組DNA的片段化：使用超聲打斷儀，將提取的基因組DNA打斷成小片段的核酸。（2）DNA小片段文庫(kù)構(gòu)建：用打斷后的小片段核酸作為起始模板，構(gòu)建文庫(kù)。主要過(guò)程：用酶反應(yīng)法將小片段核酸的5′端突出末端補(bǔ)平，或?qū)?′端突出末端削平后用T4 DNA 連接酶連接在DNA片段兩端，回收合適范圍的片段。用PCR擴(kuò)增法富集。再次進(jìn)行片段選擇、純化。（3）測(cè)序：將DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。使用的儀器：IlluminaHiSeq2500 測(cè)序平臺(tái)。（4）分析：將高通量測(cè)序結(jié)果通過(guò)比對(duì)軟件將每個(gè)測(cè)序Reads匹配到其所在的染色體上。隨后做相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化Z值分析，通過(guò)Z 值進(jìn)行染色體異常判定[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以（）表示計(jì)量資料；比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用字檢驗(yàn)；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織培養(yǎng)結(jié)果：將94例胚胎停育患者的絨毛標(biāo)本進(jìn)行長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)，成功率達(dá)100%。其中檢出正常核型45例，正常率達(dá)47.9%；異常核型49例，異常率達(dá)52.1%。

2.2 絨毛細(xì)胞異常核型的類型分析：對(duì)檢出的49例標(biāo)本進(jìn)行染色體的異常類型分析：檢出常染色體三體的異常率47.06%（16/34），明顯高于三倍體20.59%（7/34）、四倍體8.82%（3/34）、嵌合體 8.82%（3/34）、性染色體單體 8.82%（3/34）及結(jié)構(gòu)異常5.88%（2/34）等類型檢出率，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

二胎政策開放以來(lái)，很多高齡孕婦在患有高血壓、糖尿病、瘢痕子宮等情況下受孕，且年齡逐漸增高。相關(guān)數(shù)據(jù)表示，造成胚胎停育的主要因素有感染、免疫、內(nèi)分泌及遺傳等因素，其中遺傳因素占最主要因素，約60%以上的胚胎停育患者是胎兒染色體異常所致。遺傳因素致使的胚胎停育，不僅造成本次妊娠的不良結(jié)局，也對(duì)患者今后的妊娠帶來(lái)不同程度的影響。因此明確胚胎停育的原因?qū)φＨ焉锞哂兄匾饬x。對(duì)下一次妊娠進(jìn)行有效的科學(xué)指導(dǎo)，避免過(guò)度使用藥物進(jìn)行備孕。

絨毛組織的染色體結(jié)構(gòu)、物遺傳特性、胎兒的染色體結(jié)構(gòu)等基本一致，且絨毛組織的細(xì)胞分裂能力強(qiáng)。對(duì)采集的絨毛細(xì)胞用相應(yīng)的體外培養(yǎng)手段集取足夠的處于分裂中期的絨毛細(xì)胞進(jìn)行分析、研究胚胎的遺傳學(xué)。

本組研究應(yīng)用消化培養(yǎng)法獲取絨毛細(xì)胞染色體的分裂相。應(yīng)用高通量測(cè)序分析絨毛細(xì)胞異常核型的構(gòu)成，提示絨毛細(xì)胞異常核型最常見的類型是常染色體三體，且正常遺傳物質(zhì)的異常染色體的主要表現(xiàn)形式：斷裂、倒置、移位等的結(jié)構(gòu)異常；單倍體、三倍體及多倍體等的數(shù)目異常。胚胎停育染色體主要的絨毛細(xì)胞異常核型類型是數(shù)目異常，其中常染色體三體異常最為常見。胚胎在受精卵早期卵裂、性細(xì)胞成熟的過(guò)程中，因多種遺傳因素造成染色體異常分離，導(dǎo)致染色體數(shù)目異常。染色體數(shù)目增多形成數(shù)目異常的染色體三體、三倍體等。通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行多方面的檢查明確是否因內(nèi)分泌、環(huán)境、免疫等方面的影響因素導(dǎo)致胚胎停育，進(jìn)而在下次或以后的妊娠中避免這些影響因素[4]。

本組研究提示，產(chǎn)前進(jìn)行遺傳學(xué)細(xì)胞核型分析，對(duì)保證妊娠安全起重要作用。通過(guò)培養(yǎng)絨毛細(xì)胞、應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)、分析絨毛細(xì)胞核型、判斷胚胎染色體是否異常、進(jìn)一步分析核型的異常類型（重點(diǎn)警惕染色體數(shù)目異常，尤其是常染色體三體異常的絨毛細(xì)胞），對(duì)染色體異常的患者應(yīng)及時(shí)給予干預(yù)或終止妊娠，避免發(fā)生不良妊娠結(jié)局。對(duì)于已發(fā)生胚胎停育的患者，若檢出絨毛細(xì)胞異常核型應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的患者遺傳學(xué)分析，明確導(dǎo)致絨毛細(xì)胞核型即胚胎核型異常的原因，正常絨毛細(xì)胞胚胎停育的患者則需通過(guò)免疫因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素等進(jìn)行多方面分析，明確導(dǎo)致胚胎停育的非遺傳影響因素，進(jìn)而通過(guò)針對(duì)性干預(yù)措施降低再次妊娠的胚胎停育發(fā)生率[5-8]。

4 結(jié)論

胚胎停止發(fā)育的原因（感染、免疫異常、染色體異常等）復(fù)雜。傳統(tǒng)的絨毛組織培養(yǎng)，染色體核型分析方法只能檢測(cè)10Mb以上片段的重復(fù)、缺失，無(wú)法檢測(cè)出微小的片段缺失和片段重復(fù)，而高通量測(cè)序可以檢出200kb以上的片段重復(fù)和片段缺失。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析絨毛染色體的核型，可以有效的明確患者胚胎停育的原因。

綜上所述，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)有利于對(duì)早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防以及早治療，對(duì)于既往有過(guò)胚胎停育史育齡期婦女，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的檢查。盡早篩查、明確病因、避免漏診，便于及時(shí)針對(duì)性的采取積極措施，有效減少胚胎停育的發(fā)生，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育有重大意義。

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