胚胎停育和人流后組織中基因變化分析

李妺　南芳芳

【摘 要】目的：通過運用高通量測序技術來研究染色體異常所導致的流產遺傳機制，并探尋胚胎停止發育和絨毛組織中染色體發生異常的相關危險因素，有利于科學的干預、指導育齡期女性出現胚胎停止發育的現象。方法：采集發生胚胎停育的94名患者的流產后絨毛組織（2017年5月至2018年5月，山東省東營市勝利石油管理局勝利醫院婦科），標本培養后運用高通量測序技術對染色體進行核型分析。結果：收集標本全部培養成功，檢測結果中染色體結構異常5例；染色體數目異常37例；異常核型49例。結論：染色體異常是導致胚胎停育的重要原因。及時發現并治療，對優生優育有重大意義。

【關鍵詞】胚胎停育；絨毛組織；高通量測序

【中圖分類號】R394.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）23--01

高通量測序（High-Throughput Sequencing）又稱下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對于傳統的桑格測序（Sanger Sequencing）而言的。高通量測序技術具有高解析度、高輸出量的特性，極大的減少了測序的費用和時間，發現核型分析技術檢測不到的CNV。作為疾病的一項生物學標志，染色體的擴增和缺失等變化，已經成為許多疾病的研究熱點。異常DNA拷貝數變異（CNV，Copy number variations）是導致人類許多疾病（遺傳性疾病、癌癥等）的重要分子機制。致病性的CNV可以導致胚胎停育，如果發現該類CNV，即可告知孕婦（自然受孕很難得到健康的孩子）需要進行輔助生殖技術受孕，對實現優生優育具有極其重大的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取發生胚胎停育的94名患者（2017年5月至2018年5月，山東省東營市勝利石油管理局勝利醫院婦科），經手術清宮或藥物流產后，收集的94例絨毛組織標本作為研究對象。采集標準：患者年齡：23-43歲（其中高齡孕婦16人，試管嬰兒5人）；孕周：6-10周（均為單胎妊娠）。納入標準：所有患者對本組研究完全知情同意，均明確為胚胎停育；超聲檢查無原始血管波動，無胚芽[1]。排除標準：感染因素患者；家族遺傳史；免疫功能異常；凝血機制障礙[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 采集樣本情況：患者均因胚胎停育行清宮術或藥物流產終止妊娠，終止妊娠后采集標本量不低于10mg的絨毛組織。

1.2.2 母體污染觀察：將絨毛用生理鹽水反復沖洗5-10次，沖洗（母血及污染物）干凈直至沒有明顯紅色血樣污染物為止。

1.2.3 樣本保存溫度為冷凍狀態，運輸條件為低溫運輸。

1.2.4 DNA降解情況需要注意，采集樣本后需要盡快冷凍運輸，避免時間間隔過長，發生DNA降解。

觀察并記錄培養成功的標本，統計分析標本的絨毛細胞核型，根據絨毛標本是否存在異常核型來進行分組，并用高通量測序技術來分析胚胎停育的染色體異常類型及常見絨毛組織的異常核型的差異。高通量測序：收集新鮮冷凍的流產組織物，取絨毛組織10mg（不少于10mg），從中提取基因組DNA。（1）基因組DNA的片段化：使用超聲打斷儀，將提取的基因組DNA打斷成小片段的核酸。（2）DNA小片段文庫構建：用打斷后的小片段核酸作為起始模板，構建文庫。主要過程：用酶反應法將小片段核酸的5′端突出末端補平，或將3′端突出末端削平后用T4 DNA 連接酶連接在DNA片段兩端，回收合適范圍的片段。用PCR擴增法富集。再次進行片段選擇、純化。（3）測序：將DNA文庫進行測序。使用的儀器：IlluminaHiSeq2500 測序平臺。（4）分析：將高通量測序結果通過比對軟件將每個測序Reads匹配到其所在的染色體上。隨后做相應標準化Z值分析，通過Z 值進行染色體異常判定[3]。

1.3 統計學處理 應用 SPSS 19.0統計學軟件分析數據，以（）表示計量資料；比較采用t檢驗；計數資料采用字檢驗；以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絨毛組織培養結果：將94例胚胎停育患者的絨毛標本進行長期細胞培養，成功率達100%。其中檢出正常核型45例，正常率達47.9%；異常核型49例，異常率達52.1%。

2.2 絨毛細胞異常核型的類型分析：對檢出的49例標本進行染色體的異常類型分析：檢出常染色體三體的異常率47.06%（16/34），明顯高于三倍體20.59%（7/34）、四倍體8.82%（3/34）、嵌合體 8.82%（3/34）、性染色體單體 8.82%（3/34）及結構異常5.88%（2/34）等類型檢出率，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

二胎政策開放以來，很多高齡孕婦在患有高血壓、糖尿病、瘢痕子宮等情況下受孕，且年齡逐漸增高。相關數據表示，造成胚胎停育的主要因素有感染、免疫、內分泌及遺傳等因素，其中遺傳因素占最主要因素，約60%以上的胚胎停育患者是胎兒染色體異常所致。遺傳因素致使的胚胎停育，不僅造成本次妊娠的不良結局，也對患者今后的妊娠帶來不同程度的影響。因此明確胚胎停育的原因對正常妊娠具有重要意義。對下一次妊娠進行有效的科學指導，避免過度使用藥物進行備孕。

絨毛組織的染色體結構、物遺傳特性、胎兒的染色體結構等基本一致，且絨毛組織的細胞分裂能力強。對采集的絨毛細胞用相應的體外培養手段集取足夠的處于分裂中期的絨毛細胞進行分析、研究胚胎的遺傳學。

本組研究應用消化培養法獲取絨毛細胞染色體的分裂相。應用高通量測序分析絨毛細胞異常核型的構成，提示絨毛細胞異常核型最常見的類型是常染色體三體，且正常遺傳物質的異常染色體的主要表現形式：斷裂、倒置、移位等的結構異常；單倍體、三倍體及多倍體等的數目異常。胚胎停育染色體主要的絨毛細胞異常核型類型是數目異常，其中常染色體三體異常最為常見。胚胎在受精卵早期卵裂、性細胞成熟的過程中，因多種遺傳因素造成染色體異常分離，導致染色體數目異常。染色體數目增多形成數目異常的染色體三體、三倍體等。通過對患者進行多方面的檢查明確是否因內分泌、環境、免疫等方面的影響因素導致胚胎停育，進而在下次或以后的妊娠中避免這些影響因素[4]。

本組研究提示，產前進行遺傳學細胞核型分析，對保證妊娠安全起重要作用。通過培養絨毛細胞、應用高通量測序技術、分析絨毛細胞核型、判斷胚胎染色體是否異常、進一步分析核型的異常類型（重點警惕染色體數目異常，尤其是常染色體三體異常的絨毛細胞），對染色體異常的患者應及時給予干預或終止妊娠，避免發生不良妊娠結局。對于已發生胚胎停育的患者，若檢出絨毛細胞異常核型應進行進一步的患者遺傳學分析，明確導致絨毛細胞核型即胚胎核型異常的原因，正常絨毛細胞胚胎停育的患者則需通過免疫因素、內分泌因素、環境因素等進行多方面分析，明確導致胚胎停育的非遺傳影響因素，進而通過針對性干預措施降低再次妊娠的胚胎停育發生率[5-8]。

4 結論

胚胎停止發育的原因（感染、免疫異常、染色體異常等）復雜。傳統的絨毛組織培養，染色體核型分析方法只能檢測10Mb以上片段的重復、缺失，無法檢測出微小的片段缺失和片段重復，而高通量測序可以檢出200kb以上的片段重復和片段缺失。應用高通量測序技術分析絨毛染色體的核型，可以有效的明確患者胚胎停育的原因。

綜上所述，結合高通量測序技術有利于對早發現、早預防以及早治療，對于既往有過胚胎停育史育齡期婦女，應進行相關的檢查。盡早篩查、明確病因、避免漏診，便于及時針對性的采取積極措施，有效減少胚胎停育的發生，對優生優育有重大意義。

參考文獻

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