HPLC法測定綠咖啡豆提取物中有效成分的含量

邢新鋒　葉強

【摘 要】目的：建立測定綠咖啡豆提取物中綠原酸的HPLC方法，測定和比較不同綠咖啡豆提取物綠原酸的含量。方法：采用十八烷基鍵合硅膠填充柱（C18（2），100A，4.6×250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）為流動相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）為流動相B，梯度洗脫為0～20min，0～100%A，100～0%B；20–30min，100%A，0%B；30～32min，100～0%A，0～100%B；32～40min，0%A，100%B，體積流量為1.5mL/min；柱溫25℃；檢測波長為330nm；進樣量10μL。結果：綠原酸在0.02～0.20μg呈線性良好關系；其平均回收率（n=18）為99.73%。結論：該法簡便，重復性好，可用于綠咖啡豆提取物中綠原酸成分的含量測定。

【關鍵詞】綠咖啡豆提取物；綠原酸

Abstract：Objective To establish an HPLC method for determination chlorogenic acid from Green coffee been extract，determinate and compare the contents of chlorogenic acid from different Green coffee been extract. Methods： The HPLC system consisted of a C18 （4.6×250 mm，5 ?m），the mobile phase A was acetonitrile-water-formic acid（250：750：1，v/v/v），the mobile phase B was acetonitrile-water-formic acid（100：900：1，v/v/v）.The gradient elution condinations： 0～20 min，0～100%A，100～0%B，20 – 30 min，100%A，0%B，30～32 min，100～0%A ，0～100%B，32～40 min，0%A，100%B，The flow rate was 1.5 mL/min and the column temperature was 25 ，The detection wavelength was 330 nm and the injection volume was 10 μl. Results： The calibration curves of chlorogenic acid had good linear relationship in the ranges of 0.02～0.20 μg，And the average recoveries （n=18） of chlorogenic acid was 99.73%，respectively. Conclusion： This method can be applied to determinating the components from Green coffee been extract.

Key words： Green coffee been extract；chlorogenic acid

【中圖分類號】R284 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）23-0-01

綠咖啡豆提取物（Green coffee been extract）是以咖啡樹Coffea arabica L.或羅布斯塔Coffee robusta L.成熟的種子去殼后經水或一定比例的乙醇水溶液提取分離制成的植物提取物，其中有效成分主要為綠原酸，具有降壓、抗腫瘤、補腎、抗氧化等作用，也可用作保健食品中，使保健食品香甜可口味道好。目前天然植提行業中已了解的綠原酸成分有3-咖啡酰奎尼酸（3-CQA）， 5-咖啡酰奎尼酸（5-CQA）， 4-咖啡酰奎尼酸（4-CQA）， 5-阿魏酰奎尼酸， （5-FQA）， 3，4-二咖啡酰奎尼酸（3，4-diCQA）， 3，5-二咖啡酰奎尼酸 （3，5-diCQA）， 和4，5-二咖啡酰奎尼酸 （4，5-diCQA）。雖已有不少綠原酸成分的研究，但對綠原酸含量的測定卻未見文獻報道。故本研究建立了HPLC法測定現在市場中主要的綠咖啡豆提取物中綠原酸的含量的方法，為綠咖啡豆提取物的質量評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-15C高效液相色譜儀；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）；HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；AE240電子天平（梅特勒-托利多）。UV-1800紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）。

1.2 試藥 樣品由浙江天草生物科技有限公司生產提供的樣品（批號：20161001、20161002、20161003）以及多種市售產品的樣品組成。具體樣品信息見表1。對照品由浙江天草生物科技有限公司生產提供（批號：20160801） 含量：98.5%。水為娃哈哈純凈水（娃哈哈集團有限公司），甲酸（色譜級），乙腈（色譜級）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用十八烷基鍵合硅膠填充柱（C18（2），100A，4.6250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）為流動相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）為流動相B，按表2中的要求進行梯度洗脫；柱溫25℃；檢測波長為330nm；流速為1.5mL/min；進樣量10μL。理論板數按綠原酸峰計算應不低于10000。

對照品特征圖譜中呈現7個特征峰，其中與綠原酸參照物峰相應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間在規定值的±5%之內。規定值為：0.66（3-咖啡酰奎尼酸/3-CQA），1.00（綠原酸），1.06（4-咖啡酰奎尼酸/4-CQA），1.53（5-阿魏酰奎尼酸/5-FQA），2.27（3，4-二咖啡酰奎尼酸/3，4-diCQA），2.39（3，5-二咖啡酰奎尼酸/3，5-diCQA），2.55（4，5-二咖啡酰奎尼酸/4，5-diCQA）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品10mg于10mL量瓶中，加60%甲醇溶液8ml，超聲使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取5mL至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取各樣品25mg，置50mL量瓶中，加60%甲醇溶液40mL，超聲使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察 精密吸取綠原酸對照品溶液適量，加流動相溶解并稀釋，分別精密制成濃度為0.02 mg/mL、0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL和0.20mg/mL的溶液，搖勻，分別精密量取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品的濃度（c）為橫坐標，綠原酸面積（A）為縱坐標，計算線性回歸方程，并繪制標準曲線，結果見表3。

2.4 定量限和檢測限 按照“2.1”項下色譜條件，采用對照品溶液稀釋，進樣測定。分別以3倍和10倍標準偏差對應的濃度值為測定方法的檢出限和定量限。結果見表4。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，根據主峰峰面積計算進樣精密度，結果見表5。

進樣精密度試驗結果說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取樣品1（批號20161001）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，測定6份樣品的含量，計算精密度，結果見表6。

2.7 穩定性試驗 取樣品1（批號20161001）粗粉適量，在同一實驗室里，在不同的時間內，由不同的實驗者，在不同的儀器上，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，得實驗的穩定性，結果見表7。

結果表明實驗結果穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取已測定含量的綠咖啡豆提取物樣品1（批號：20161001）共18份，每份精密稱量，稱量的結果如下表，配制80%、100%、120%三個濃度的供試品溶液各六份，按照“2.1”項下色譜條件分析，按外標法以峰面積計算，結果見表8。

2.9 樣品的測定 取樣品1～10適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中含100μg的溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取綠原酸對照品適量，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得，結果見表9。

測定結果顯示目前綠咖啡豆提取物主要產品中綠原酸含量都在20%以上，總綠原酸都在40%以上，可以以此作為綠咖啡豆提取物的質量評價標準。

3 討論

本實驗采用HPLC法測定綠咖啡豆提取物中主要有效成分綠原酸的含量，方法簡便，重復性好，可用于快速測定綠咖啡豆提取物中綠原酸的含量，為綠咖啡豆提取物的質量評價提供了新的科學參考依據。