PCR技術在食品微生物檢測中的運用

◎ 陳永燕，李虹紅

（梅州市食品藥品監督檢驗所，廣東 梅州 514000）

民以食為天，現在人們不再單單只要求能夠吃飽，還要吃得安全、吃得放心。食品安全是關系民生的重大問題，但近些年的食品安全問題層出不窮，前些年的毒奶粉事件之后又是連續的毒饅頭、地溝油和水果農藥含量超標等食品安全問題。這迫切要求提高食品的檢測技術，以保證人們的飲食安全。食品中微生物含量的檢測是食品檢測中非常重要的一環，很多食物無法食用就是因為微生物的含量超標，加速了食物的腐敗。近些年來，PCR檢測技術逐漸出現在人們的視線中，該技術因其快速、簡便、準確的優點受到業內專業人士的青睞。

1 PCR技術介紹

1.1 PCR技術原理

PCR技術早在1971年的時候由Khorana提出了設想，在當時這種技術被認為是不可能的，后來經過十幾年的發展，到了1985年時被美國科學家Kary Mullis正式研究出來。PCR技術（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）被研究出之后立即就成為基因工程中的重要技術手段，為食品的微生物檢測領域帶來了新的快捷的方法。目前，我國的食品檢測科學工作者正致力于將PCR技術應用在啤酒等日常食物的微生物含量的檢測中，不但是我國，許多發達國家如美國、加拿大、日本等也在進行這項工作。利用PCR技術進行檢測的基本原理是在PCR體系下將食物加溫，如果食物中存在微生物，則它們的核酸序列由于外界的高溫會發生變性。一般PCR體系剛開始時溫度可以達到94 ℃（溫度不可以過高，否則微生物會被直接殺死），微生物的DNA在這個溫度下會裂解成單鏈。然后降溫，將PCR體系中的溫度直接下調到55 ℃，再將體系溫度升到72 ℃，引物會與模板DNA結合，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈，之后就是重復以上步驟。最后只要檢測產物中是否含有特異性的DNA片段即可。特異性引物只可以生長在微生物上，而且比微生物要容易檢測。這樣的檢測技術不但結果更加準確，還可以對目的片段進行測序，確定是何種微生物[1]。

1.2 PCR技術需要使用的原料

要想利用PCR技術，需要多種原料相互作用。由于PCR技術的進步，目前使用的原料較之以前又有增加。①特異性的引物，這種引物必須事先準備好，這些引物只能與微生物發生關系，不能夠隨意結合到食物的其他成分上，且不可以過長，最好是15～20個堿基長度。引物之間不可以發生互補反應，引物的設計和合成直接決定了PCR技術能否成功，因此必須要嚴格對待。②DNA聚合酶，主要作用是促使引物與微生物的DNA結合。引物是一小段特定的DNA，但是要使其自動與微生物DNA結合存在一定的困難，而DNA聚合酶具有一定的催化功能，可促使這一目標達成。現階段使用的主要是Tap DNA酶，這種聚合酶具有良好的耐高溫性，即便是在90 ℃下也不會失活。③緩沖液。一般而言，緩沖液與DNA聚合酶是配套使用的，因為聚合酶的活性比較差，容易受到外界物質的影響，所以需要一定的保護。在緩沖液的作用下，引物與微生物之間更容易發生聯系。④Zn2+離子，它可為聚合酶提供足夠的活力，保證其發揮良好的催化作用。Zn2+離子濃度直接會影響PCR產物的數量，因此在進行檢測時對于Zn2+的濃度一定要掌握好，否則測量出的結果將會不準確[2]。

2 PCR技術的實際應用

2.1 對食品中致病菌的檢測

食品中的致病菌對于人體的健康有很大的危害，且致病菌的種類很多，如立克次氏體、衣原體、支原體、病毒、真菌等，為了保證食物不會對人體產生危害，這些致病菌的含量必須控制在合理范圍內。在檢測時，首先需要將這些致病菌的樣本提取出來，通過高速離心的方式將致病菌分離出來，在高溫條件下將它們裂解得到核酸。之后要研究致病菌DNA的排列順序，盡可能選擇出致病菌群中有代表性的DNA片段，在選擇靶DNA后根據其序列研制能與之結合的特異性引物，以上工作做好之后才可以對食物中的致病菌含量進行檢測，只要檢測到含有引物的DNA中具有之前選定好的靶DNA片段即表明這個是致病菌細胞。目前，測定食物中的沙門氏菌、變形弧菌、大腸桿菌等致病菌都采用這種方式，而且經過多次驗證，PCR技術比傳統檢測方式更加迅速、精確。

2.2 對食品中乳酸菌的檢測

乳酸菌是一類可以產生乳酸的細菌的總稱，目前發現的大部分乳酸菌都是有益菌，特別是在促進人類健康生長、幫助腸胃消化、改善腸道功能、降低血清內的膽固醇含量、提高機體的免疫力這些方面有很大的幫助，但其中一部分乳酸菌對人體有害，所以人們在購買食物時對于乳酸菌的含量格外看重，這就要求對于乳酸菌含量的測量也必須更加準確。對于乳酸菌的檢測，我國開始研究的時間比較早，科研人員發現乳酸菌的DNA序列在1414～1432位置的21個堿基排列非常有代表性，而且并不是只有一種乳酸菌擁有這種排列，雙歧桿菌等前前后后共有32種乳酸菌被發現具有此代表性的堿基排列，因此目前對乳酸菌含量的檢測主要是針對這21個堿基序列。要想得到這個序列，只需要利用SDS方法將乳酸菌細胞裂解，再利用蛋白酶將細胞中的蛋白質去掉即可得到完整的乳酸菌核酸，再將自己所需的基因片段提取出來研究相應的引物，因為這個片段是乳酸菌特有的，所以不用擔心引物會與其他物質結合，從而達到檢測乳酸菌含量的目的。

2.3 對食品中啤酒腐敗菌的檢測

啤酒是人們生活中常見的食品，而且目前我國的啤酒產量很大，啤酒的種類也很多。眾所周知，啤酒是通過發酵得到的，其中扮演著重要角色的就是乳酸桿菌。啤酒的主要原料啤酒花中含有一定量的異A酸，這種酸有一定的抑菌作用，但是乳酸桿菌特別是乳桿菌對這種酸的存在有很大的影響，有日本學者認為啤酒的腐敗與乳桿菌有直接關系。經過研究發現，軟桿菌上能夠抑制異A酸生長的是一種horA基因，而能夠引起啤酒變質的乳桿菌幾乎都含有這種基因，從而證明了horA基因對啤酒花存在一定的抗性。在得到這個結論之后，日本的科研人員立刻根據horA的基因順序合成了特異性引物，再加上DNA聚合酶和乳桿菌的DNA提取液，利用電泳對最后的產物進行檢測，得到的結論與之前他們調配的濃度十分接近，由此啤酒中的腐敗菌檢測手段被研發出來，這種方法檢測時間只需要6 h，而傳統的平板培養方法至少需要3 d，在效率上有了很大的提高。

3 結語

食品的檢測在朝著高效、快捷、方便的方向發展，PCR技術無疑是滿足以上需求的。但實際上，PCR技術還存在著一定的缺陷，如對于細胞內存在能夠破壞聚合酶的真細菌就無法使用該技術。但是，相信在不久的將來，PCR技術一定可以完善自身，不再僅僅局限于食物的微生物檢測，人體免疫學、分子生物學都有可能使用到PCR技術。

[1]李 勤，盛占武，孫志高，等.實時熒光定量PCR技術在食品微生物檢測和研究中的應用[J].四川食品與發酵，2010，42（5）：9-12.

[2]徐 巖，張麗萍，顧國賢.聚合酶鏈式反應（PCR）技術鑒定啤酒腐敗菌的最新進展[J].釀酒科技，2000，27（5）：71-74.