口蹄疫液相阻斷ELISA實驗中常遇問題及詳細操作步驟

王秀東，鄒德穎，郭興，那永東，翟偉，曹凱捷

（盤錦檢驗檢測中心，遼寧 盤錦 124010）

酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 是一種用酶標記已知的抗原或抗體，并使之吸附在固相載體表面發生抗原抗體反應，用于檢測大分子抗原和特異性抗體的技術[1]。在口蹄疫病毒抗體檢測中，液相阻斷ELISA實驗是農業部規定的檢驗標準，判定結果較為客觀，而且能夠有效評價接種了FMD疫苗的動物的抗強毒攻擊能力。由于酶聯免疫吸附實驗步驟較為復雜，且環環相扣，一旦某個環節出現問題，將影響到實驗結果的準確性，因此必須明晰其實驗流程及注意事項。

1 口蹄疫液相阻斷ELISA實驗中常遇問題

相對來說，口蹄疫液相阻斷ELISA實驗的過程是比較漫長的，實驗者常遇到以下幾個問題：①說明書過于精要，實驗步驟不明晰，導致實驗流程混亂，操作不嚴謹，還有可能會出現實驗過程中用錯試劑的情況；②在抗原抗體反應中，需要用到96孔U型板進行血清稀釋，有時候實驗者會將ELISA反應板與之混淆；③在抗原抗體反應稀釋血清的環節，實驗步驟較復雜，而且要兩次調整移液器量程，如果沒有按照實驗步驟調整刻度值，將導致所加PBST液量錯誤，繼而導致稀釋倍數計算錯誤；④酶聯免疫吸附板條未牢牢固定在板架上，在洗板甩干/脫干的環節容易脫落，如果之前未加標記，很容易分不清樣品序號順序 。

針對上述情況，可采取以下措施有效避免：①仔細閱讀說明書，揣摩其中含義。逐字逐句閱讀說明書，對于有疑問或不理解的詞語，應自己查閱資料了解，如果不明確實驗步驟，可以詢問實驗經驗豐富的人，直到基本掌握實驗操作步驟；②做好實驗準備工作。在實驗中，所用實驗器材有5～50μL的單道移液器及多道移液器、50～300μL的多道移液器、、加樣槽、廢棄液瓶，以及20mL、50mL、250mL、500mL量筒，以及300mL、500mL燒杯，準備好足夠數量的實驗器材，檢查試劑是否齊全，根據實驗人員數量準備足夠的96孔U型反應板。

2 口蹄疫液相阻斷ELISA實驗詳細操作步驟

2.1 配備PBST液

一般情況下，一板實驗需要用到500mL1倍PBST液，因此可根據實驗板書計算藥液用量，再使用25倍PBST濃縮液配置1倍PBST液。檢查25倍PBST濃縮液平底有無結晶，如無可直接稀釋，若有則置入水浴鍋中直至結晶融化再稀釋，20mL量筒量取20mL濃縮液，倒入500mL量筒中，加蒸餾水至500mL刻度線，混勻，倒入加樣槽內。

2.2 抗原抗體反應

實驗過程的具體步驟如下：①稀釋血清。以每板檢測10份血清為例，取潔凈的96孔U型反應板，采用50～300μL的多道移液器，刻度調至75μL，吸取1倍PBST液加入A1～A10孔中；刻度調整至50μL，往A～H行的1～11列孔、A12、B12中加入1倍PBST液。使用5～50μL的單道移液器，吸取25mL檢測血清，加入A1～A10孔中；將多道移液器的刻度調整至50μL，插入A1～A10孔中反復吸取數次，混勻，再吸取50μL藥液，加入到對應的B列孔中，重復上述操作，將同一列的液體50mL吸取到下一行的孔中，直至H列，最后吸取50μL藥液棄去，使得從A列到H行，血清稀釋倍數依次為1∶4、1∶8……1∶512。在A11孔加入陽性血清50μL，采用相同的方式進行稀釋，使其稀釋倍數為1∶16、1∶32……1∶2048，在A12孔中加入陰性血清50μL，稀釋至B12，稀釋濃度分別為1∶2、1∶4；②添加病毒抗原。通常一板實驗需要5mL抗原，根據實驗板數計算工作濃度抗原數量，根據實際濃度，稀釋抗原，并多配置2～3mL備用，按照說明書的要求加入反應板孔中，封板，輕微振蕩，37℃恒溫箱中放置90min。

2.3 余下實驗步驟

在抗原抗體實驗后，所需進行的實驗步驟有：①轉移抗體抗原混合液，根據說明將抗原抗體混合液轉移至口蹄疫O型、A型或者亞洲I型相應的ELISA反應板中，每孔50μL，封板，37℃恒溫箱中溫育60min；②洗板。棄掉ELISA板中液體，移液器吸取1倍PBST液260至280μL置入孔中，再甩出，重復3～5次，吸水紙拍干；③添加口蹄疫O型或A型豚鼠抗體。往ELISA板各孔中加入ELISA板中50μL口蹄疫O型、A型或者亞洲I型豚鼠抗體，封板，37℃溫育30min；④洗板；⑤加兔抗豚鼠酶結合物；⑥加底物；⑦加終止液，記錄酶標儀刻度值。

3 結語

口蹄疫液相阻斷酶聯免疫吸附實驗步驟繁多，如果做實驗的人不嚴格按照實驗步驟進行操作，很有可能得到不成立的實驗結果，前功盡棄，影響到病毒抗體檢測工作效率及質量[2]。對于實驗者，尤其是初學者，在做實驗之前，最好能夠詳細閱讀說明書，不放過其中的任何一個字眼，仔細揣摩其中的意思，直到能夠記住實驗步驟及其中的一些注意事項。

[1]李世鳳,吳得瑞.淺析影響口蹄疫O型液相阻斷ELISA實驗的因素[J].中獸醫學雜志,2017,(01):72.

[2]王娟娟.口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測兩種實驗方法結果對比[J].吉林畜牧獸醫,2017,38(08):5-6.