創傷膿毒癥患兒外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例變化及其意義

高 強，李政委，李大進，朱炳鑫，秦海輝

(徐州醫科大學附屬徐州兒童醫院創傷外科 221006)

膿毒癥為創傷外科常見的全身炎性反應綜合征，發病率較高，可誘發器官衰竭綜合征，嚴重時可能導致死亡[1]。膿毒癥并非僅僅是過度炎性反應，它是炎性反應和抗炎反應相互作用過程中機體免疫功能紊亂的結果。膿毒癥病程進展過程中，涉及機體多種免疫細胞之間平衡的失調和免疫調節網絡的紊亂。兒童由于自身免疫功能尚不完善，在發生嚴重創傷時，更易由感染誘發膿毒癥，造成嚴重后果。調節性T細胞(Tregs)是T淋巴細胞的一個亞群，具有強大的免疫抑制功能，是維持人體免疫系統穩態不可或缺的一部分。曾一度被認為僅存在于胸腺來源的CD4+Foxp3+T細胞之中的轉錄因子Helios在Tregs中呈高水平表達[2-3]。Helios是維持CD4+Foxp3+T細胞穩定抑制能力所不可或缺的角色[4]，同時是具有抑制功能的調節性T細胞的標記物[5-6]。既往研究表明，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例在多種免疫相關的疾病中扮演了重要角色，但其在兒童創傷后膿毒癥中的作用鮮有報道[7-11]。本研究旨在通過檢測創傷膿毒癥患兒外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例的變化，分析Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例與相關細胞因子表達水平間的潛在關系，探討Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例在兒童創傷膿毒癥中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2015年1月至2017年6月收治的60例創傷膿毒癥患兒納入膿毒癥組，經病原學及影像學檢查確診，符合2005年國際兒科膿毒癥年會所制定的小兒膿毒癥診斷標準[1]，其中男36例，女24例；平均(8.56±2.33)歲。選擇同期入院但未發生膿毒癥的60例創傷兒童納入創傷組，其中男32例，女28例；平均(9.21±3.12)歲。同期本院60例健康體檢者納入對照組，其中男30例，女30例；平均(8.94±2.79)歲。所有研究對象排除標準：患有自身免疫疾病、嚴重的慢性疾病、或是長期服用糖皮質激素的兒童。本研究經本院倫理委員會審核通過后進行，所有研究對象監護人均對本研究知情同意。

1.2方法 所有研究對象均空腹8 h后抽取靜脈血2 mL于肝素抗凝管內，室溫靜置30 min后以300×g速度離心7 min，分離上層血漿，分裝保存于-80 ℃冰箱內待測。用淋巴細胞分離液對血細胞進行密度梯度離心，分離得到單核淋巴細胞；對單核淋巴細胞進行特異性抗體染色后進行流式細胞學檢測，并采用Flowjo V10軟件進行流式數據分析。應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測血漿中細胞因子白細胞介素(IL)-10、轉化生長因子(TGF)-β1的水平。應用實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術，檢測外周血單核淋巴細胞中轉錄因子Helios及Foxp3的mRNA表達水平。

2 結 果

2.13組研究對象Tregs比例檢測結果比較 膿毒癥組、創傷組及對照組外周血中轉錄因子Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例分別為(85.37±11.25)%、(66.56±10.86)%、(63.72±9.88)%，膿毒癥組明顯高于創傷組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。膿毒癥組、創傷組及對照組外周血CD4+Foxp3+Tregs細胞比例分別為(7.90±1.31)%、(6.88±1.02)%、(2.79±0.31)%，膿毒癥組和創傷組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，膿毒癥組與創傷組之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.23組研究對象血漿IL-10、TGF-β1水平比較 ELISA法檢測結果顯示，膿毒癥組、創傷組及對照組血漿中IL-10水平分別為(25.46±3.67)、(20.51±2.91)、(17.47±0.89)pg/mL，膿毒癥組明顯高于創傷組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。膿毒癥組、創傷組及對照組血漿中TGF-β1水平分別為(45.26±8.62)、(41.81±7.11)、(33.79±6.97)pg/mL，膿毒癥組明顯高于創傷組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例與血漿IL-10、TGF-β1水平相關性分析 IL-10(r=0.627，P=0.001)、TGF-β1(r=0.638,P=0.001)與外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例間呈顯著正相關。

2.43組研究對象外周血單核淋巴細胞轉錄因子Helios及Foxp3的mRNA表達水平比較 膿毒癥組、創傷組及對照組外周血單核淋巴細胞Helios的mRNA表達水平分別為4.88±1.77、3.21±1.29、0.96±0.18，膿毒癥組明顯高于創傷組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。膿毒癥組、創傷組及對照組Foxp3的mRNA水平分別為3.76±1.30、3.68±1.21、0.87±0.15，膿毒癥組及創傷組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，但膿毒癥組與創傷組之間，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

2001年美國醫師協會等多個相關組織在華盛頓召開會議，將膿毒癥定義為由微生物引起的全身炎性反應綜合征[1]。美國每年約75萬人發生膿毒癥，病死率為20%～60%；我國每年也有大量膿毒癥患者，死亡人數近百萬。兒童患者免疫功能尚未發育健全，病情進展迅速，更應引起重視。膿毒癥發生時機體炎癥細胞激活，引其自身系統性炎性反應。Tregs是T細胞的組成部分，在抑制炎性反應過程中發揮重要作用，Tregs數量異常或是功能降低均可能導致機體免疫功能失調，導致疾病發生。Tregs通過產生IL-10抑制Teffs激活及后續一系列的免疫炎性反應[12-13]，并通過分泌TGF-β1抑制其他T細胞的作用，阻礙輔助T細胞及細胞毒性T細胞的激活[14-16]。Foxp3曾被認為是Tregs標記物[11,17-18]，然而進一步研究發現，Foxp3既表達于具有抑制功能的Tregs，也可以出現在效應性T細胞中[19-20]。

Helios是屬于Ikaros家族的核內轉錄因子，近期研究認為Helios是具有抑制功能的Tregs的標記物[5-6]，本研究發現，創傷膿毒癥患兒外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例相對于創傷組和對照組明顯升高，且血漿細胞因子IL-10、TGF-β1與Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例存在顯著正性相關關系。細胞因子IL-10是人類細胞因子的合成抑制因子，是具有免疫調節和抗炎作用的細胞因子，被視作Tregs標記物之一，研究證實，Tregs通過產生IL-10從而抑制Teffs激活及免疫炎性反應。TGF-β1是轉化生長因子超家族成員，它承載多項細胞功能，包括調控細胞生長繁殖，細胞分化凋亡等。Tregs能夠分泌TGF-β1，進一步抑制其他T細胞效應功能，從而抑制免疫炎癥反應。本研究發現，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達水平同以上兩種細胞因子的表達水平之間存在正相關關系，由此筆者猜測，過度表達的Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表達比例可能在創傷膿毒癥患兒疾病進展中產生了潛在的影響，抑制了機體的正常免疫炎性反應，導致疾病病程進展，但其具體作用機制仍待進一步研究。