十株乳酸菌耐酸特性及單寧酸耐受性的研究

田延楚，呂嘉櫪，余芳，張軍蒙

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

十株乳酸菌耐酸特性及單寧酸耐受性的研究

田延楚，呂嘉櫪*，余芳，張軍蒙

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

在乳酸菌發(fā)酵果蔬汁過(guò)程中，某些果蔬汁偏高的酸度和單寧酸含量是影響發(fā)酵的主要因素之一。研究采用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、糞鏈球菌、乳雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌，對(duì)其耐酸特性以及單寧酸對(duì)其生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：10株乳酸菌產(chǎn)酸量依次為2.97%，3.24%，2.83%，1.14%，3.03%，2.56%，2.7%，1.0%，0.94%，2.56%；10株乳酸菌初始生長(zhǎng)的pH值依次為4.0，3.5，4.0，4.5，3.0，4.0，3.5，4.5，4.5，3.0；而單寧酸對(duì)10株乳酸菌的生長(zhǎng)有抑制作用，10株菌對(duì)單寧酸的耐受性依次為0.25%，0.25%，0.1%，0.2%，0.15%，0.15%，0.15%，0.15%，0.1%，0.15%。

乳酸菌；耐酸特性；單寧酸

乳酸菌發(fā)酵源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，因其具有一定的有益功效，故廣泛用于食品的生產(chǎn)加工中。目前市面上有多種乳酸菌發(fā)酵食品，比如各種泡菜、漿水、香腸、面包、酸面團(tuán)等；也有多種乳酸菌發(fā)酵飲品，但絕大多數(shù)飲品在原料中添加了乳品，如各種活菌型酸乳飲品、凝固型酸奶等；還有少數(shù)純果汁和復(fù)合果蔬汁的乳酸菌飲品[1-6]。純果蔬汁進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵所用的原料一般是低酸的果蔬品種，如洋蔥、山藥、芒果、火龍果等[7-10]；而酸度較高的蘋果汁、山楂汁、藍(lán)莓汁等一般需要經(jīng)過(guò)與其他的蔬菜汁，如紅棗汁、番茄汁、胡蘿卜汁或者乳品復(fù)配后才進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵[11-15]。

在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，偏高的酸度和具有廣譜抗菌作用的單寧酸成為制約乳酸菌發(fā)酵某些高酸、高單寧酸含量的水果飲品的重要因素，使得乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品不夠豐富且某些果汁飲品風(fēng)味不夠獨(dú)特。因此，篩選出耐酸且耐單寧酸的乳酸菌是十分必要的。

本研究以10株乳酸菌為原料，主要針對(duì)其耐酸特性和單寧酸耐受性進(jìn)行相關(guān)研究，以期篩選出合適的乳酸菌并為乳酸菌和果蔬的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，簡(jiǎn)稱LP)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，簡(jiǎn)稱LC)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，簡(jiǎn)稱LCR)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，簡(jiǎn)稱ST)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，簡(jiǎn)稱LCP)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，簡(jiǎn)稱LA)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，簡(jiǎn)稱LR)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis，簡(jiǎn)稱SF)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，簡(jiǎn)稱BL)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，簡(jiǎn)稱LB)，均由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

B203LEDR生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；AC-0629普通光學(xué)顯微鏡 重慶光學(xué)儀器有限公司；單人凈化工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株活化

將10株乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的比例接株到滅菌的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，按相同的步驟再重復(fù)活化1次，備用。

1.4.2 菌株產(chǎn)酸能力的測(cè)定

用MRS培養(yǎng)基，按1%(體積比)的接株量將10株乳酸菌分別接株于培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，每隔12 h，用酸堿滴定法測(cè)定其總酸，并測(cè)其pH值。

1.4.3 菌株耐酸性的測(cè)定

培養(yǎng)基的初始pH會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)代謝所需的酶的活性以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況等產(chǎn)生影響，因此影響菌株的生長(zhǎng)情況。將滅菌的MRS培養(yǎng)基用1%(體積比)的鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，將活化好的菌株按1%(體積比)的接株量分別接入調(diào)節(jié)pH后的MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，每隔12 h，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)其OD值。

1.4.4 單寧添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在MRS培養(yǎng)基中添加單寧酸，使其含量分別達(dá)到0%，0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，按1%(體積比)的接株量將10株乳酸菌分別接株于上述培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以未接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，每隔12 h，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)其OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酸能力的測(cè)定

其中：X為總酸，g/kg；c為滴定用氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；V1為消耗氫氧化鈉體積，mL；V2為空白樣消耗氫氧化鈉體積，mL；K為換算系數(shù)，乳酸0.090；F為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，將計(jì)算結(jié)果用百分?jǐn)?shù)表示。繪圖結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 10株乳酸菌的總酸

圖2 10株乳酸菌的pH值變化情況

由圖1可知，10株乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中均可產(chǎn)酸，其中LC產(chǎn)酸最多，產(chǎn)酸量達(dá)到3.24%；其次是LCP，LP，LCR，LR，LA，LB，其產(chǎn)酸量依次為3.03%，2.97%，2.83%，2.7%，2.56%，2.56%；接著是ST，SF，產(chǎn)酸量依次為1.14%，1.0%；而B(niǎo)L的產(chǎn)酸量最少，僅為0.94%。

由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后BL的pH值為4.54，是10株菌中最高的；然后為SF，ST，依次為4.34和4.25；接著是LA，LB，LR，LCR，LP，依次為3.75，3.71，3.7，3.66，3.63；最后是LC和LCP，其中LC的pH值為3.60，LCP的pH值為3.59。與圖1的結(jié)論進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，LA和LB的產(chǎn)酸量相同，但LB的pH值更低，說(shuō)明LB產(chǎn)解離酸比LA多；LC產(chǎn)酸量最多，LCP其次，但LCP的pH值比LC低0.01，說(shuō)明LCP產(chǎn)解離酸稍多于LC；其余菌株產(chǎn)酸量和其pH值趨勢(shì)是相一致的。因此，產(chǎn)酸量結(jié)論和pH值結(jié)論基本吻合。

2.2 菌株耐酸性的測(cè)定

為了直觀地確定菌株的耐酸能力，以培養(yǎng)基的初始pH值為變量，每12 h的OD600值(未接菌的培養(yǎng)基調(diào)零)為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)圖3～圖7。

圖3 pH為2.5時(shí)10株乳酸菌的生長(zhǎng)情況

圖4 pH為3.0時(shí)10株乳酸菌的生長(zhǎng)情況

圖5 pH為3.5時(shí)10株乳酸菌的生長(zhǎng)情況

圖6 pH為4.0時(shí)10株乳酸菌的生長(zhǎng)情況

圖7 pH為4.5時(shí)10株乳酸菌的生長(zhǎng)情況

由圖3～圖7耐酸試驗(yàn)結(jié)果可知，培養(yǎng)基初始pH低于3.0時(shí)，10株乳酸菌均不能生長(zhǎng)；初始pH高于4.5時(shí)，10株乳酸菌都可以生長(zhǎng)。LCP和LB均在初始pH 3.0時(shí)有生長(zhǎng)趨勢(shì)但不明顯，LCP從12 h開(kāi)始快速生長(zhǎng)，48 h后趨于穩(wěn)定，LB也是從12 h開(kāi)始快速生長(zhǎng)，36 h后趨于穩(wěn)定；LC在初始pH增加為3.5時(shí)長(zhǎng)勢(shì)很好，且12 h開(kāi)始快速生長(zhǎng)，36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；LR和LCR在此條件下也可以生長(zhǎng)，但長(zhǎng)勢(shì)不佳，可看出LR從12 h開(kāi)始快速生長(zhǎng)，36 h后趨于穩(wěn)定，LCR在12 h內(nèi)快速生長(zhǎng)，24 h后達(dá)到穩(wěn)定期；LP和LA初始生長(zhǎng)pH為4.0，且長(zhǎng)勢(shì)良好，LP在12 h后快速生長(zhǎng)，24 h后趨于平穩(wěn)，LA的快速生長(zhǎng)期為24 h內(nèi)，其后也達(dá)到穩(wěn)定期；pH達(dá)到4.5時(shí)，BL，ST和SF均出現(xiàn)生長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)合菌株生長(zhǎng)的初始pH以及它們生長(zhǎng)良好的pH值發(fā)現(xiàn)，10株菌中LCP，LC的耐酸性最好，其次為L(zhǎng)CR，LB和LR，接著是LA，LP，而B(niǎo)L，ST和SF的耐酸性最差。

2.3 單寧酸添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

單寧酸廣泛存在于植物的各個(gè)部位，因其具有廣譜抑菌作用，故需篩選出有抗單寧作用的乳酸菌株才能發(fā)酵果蔬，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8～圖13。

圖8 單寧添加量為0時(shí)OD值

圖9 單寧添加量為0.05%時(shí)OD值

圖10 單寧添加量為0.1%時(shí)OD值

圖11 單寧添加量為0.15%時(shí)OD值

圖12 單寧添加量為0.2%時(shí)OD值

圖13 單寧添加量為0.25%時(shí)OD值

由圖8～圖13可知，隨著單寧酸添加量的增加，10株乳酸菌的OD值增加會(huì)逐漸變緩。單寧酸添加量為0%時(shí)，10株乳酸菌的OD值均大幅上升，即10株菌生長(zhǎng)良好；單寧酸添加量為0.05%時(shí)，10株乳酸菌的OD值也大幅上升，但和單寧酸添加量0%相比數(shù)據(jù)整體偏低；單寧酸添加量為0.1%時(shí)，10株乳酸菌的OD值依然上升明顯但數(shù)據(jù)整體更加偏低，說(shuō)明10株菌的生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)單寧酸添加量上升至0.15%時(shí)，可明顯看到BL和LCR的OD值沒(méi)有上升，菌株不生長(zhǎng)；單寧酸添加量繼續(xù)上升為0.2%時(shí)，LA，SF，LR，LB，LCP的OD值上升不明顯，菌株不升值；而添加單寧酸含量為0.25%時(shí)，ST的OD值也不再增加，說(shuō)明ST沒(méi)有生長(zhǎng)；在此情況下只有LC和LP的OD值上升，菌株依然生長(zhǎng)。由上述結(jié)果可知單寧酸會(huì)抑制10株乳酸菌的生長(zhǎng)，但其中也有對(duì)單寧酸表現(xiàn)出抗性作用的菌株，10株乳酸菌對(duì)單寧酸的耐受性由高到低依次為：LC，LP>ST>LB，LR，LCP，LA，SF>LCR，BL。

3 結(jié)論

本研究采用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、糞鏈球菌、乳雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌，對(duì)其耐酸特性以及單寧酸對(duì)其生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：10株乳酸菌中干酪乳桿菌產(chǎn)酸最多，乳雙歧桿菌產(chǎn)酸最少；干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌耐酸性最好，其次是羅伊氏乳桿菌和副干酪乳桿菌；而單寧酸會(huì)抑制10株乳酸菌的生長(zhǎng)，但其中有些乳酸菌對(duì)單寧酸的抑制作用不敏感，10株乳酸菌株中對(duì)單寧酸的耐受性最好的是干酪乳桿菌和植物乳桿菌，其對(duì)單寧酸的耐受性可達(dá)0.25%以上。乳酸菌對(duì)單寧酸的耐受性可能是由于其可以分泌單寧酶與單寧結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而降低單寧的抑制性，也可能是由于其含有的酶不含金屬離子，故單寧酸不能與其結(jié)合發(fā)揮抑制作用等。通過(guò)對(duì)10株乳酸菌耐酸性和單寧酸耐受性進(jìn)行研究，可以為研制以高酸、高單寧含量的果蔬品種為原料的乳酸菌制品奠定基礎(chǔ)。

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Research on Acid-resistant Characteristics and Tannic Acid Tolerance of Ten Strains of Lactobacillus

TIAN Yan-chu, LV Jia-li*, YU Fang, ZHANG Jun-meng

(College of Food and Bioengineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an 710021,China)

In the process of fermenting fruit and vegetable juice with lactobacillus, the high acidity and tannin content is one of the main factors that affect the fermentation. Ten strains of lactobacillus, such asLactobacillusplantarum,Lactobacilluscasei,Lactobacillusrhamnosus,Streptococcusthermophilus,Lactobacillusparacasei,Lactobacillusacidophilus,Lactobacillusreuteri,Enterococcusfaecalis,BifidobacteriumlactisandLactobacillusbulgaricus, are studied on the acid-resistant characteristics and the effect of tannic acid on the growth of these lactobacillus strains. The results show that the acid production amount of these ten strains of lactobacillus is 2.97%, 3.24%, 2.83%, 1.14%, 3.03%, 2.56%, 2.7%, 1.0%, 0.94%, 2.56%; the initial pH value of these ten strains of lactobacillus is 4.0, 3.5, 4.0, 4.5, 3.0, 4.0, 3.5, 4.5, 4.5, 3.0; tennic acid has effect on the growth of these ten strains of lactobacillus, and tannic acid tolerance to these ten strains of lactobacillus is 0.25%, 0.25%, 0.1%, 0.2%, 0.15%, 0.15%, 0.15%, 0.15%, 0.1%, 0.15%.

lactobacillus; acid-resistant characteristics; tannic acid

2016-10-12 *通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(59493300)；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(9800462)

田延楚(1992-)，女，陜西榆林人，碩士，研究方向：發(fā)酵工程； 呂嘉櫪(1964-)，女，陜西咸陽(yáng)人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.002

1000-9973(2017)01-0005-05