乙型肝炎病毒Pre-S/S區基因突變對乙型肝炎病毒表面抗原檢測的影響

何成山綜述 馬晨蕓， 陸志成審校

（1.蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 233000；2.上海中醫藥大學附屬第七人民醫院醫學檢驗科，上海 200137）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球公共衛生的重要問題。每年全球由HBV感染相關的急慢性肝炎、肝硬化、肝細胞性肝癌等導致的死亡人數達78.6萬[1]。全球有超過2.4億人為慢性乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶者[2]，亞太地區為高度流行區。HBV感染引起的乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）是重要的傳染病之一。我國HBV感染流行率為34.28%，1～59歲人群HBsAg陽性率為7.18%，由此推算我國目前有近5億人感染過HBV，HBsAg攜帶者約9 300萬[3]，是世界上HBsAg攜帶人口最多的國家。HBsAg是HBV的外蛋白，可以存在于感染者的血液、體液和分泌物中，是重要的病毒學血清標志物，臨床上常將其作為評估HBV感染和抗病毒治療反應的監測指標。同時，HBsAg還是輸血安全的關鍵篩查指標。目前，我國HBV DNA檢測尚未完全開展，HBsAg檢測的敏感性和特異性決定著我國輸血后乙肝的發生率。

HBV基因型根據S區核苷酸序列異源性主要分為8個基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型，其基因組含4個部分重疊的開放閱讀讀碼框，即編碼外膜蛋白的前S/S區（Pre-S/S區）、編碼核衣殼蛋白的前C/C區、編碼DNA聚合酶的P區和編碼X蛋白的X區。Pre-S/S區編碼大（L）、中（M）和小（S）3種表面蛋白。S蛋白包含226個氨基酸，即HBsAg；M蛋白包含S蛋白和55個氨基酸長度的pre-S2蛋白，L蛋白包含M蛋白和108～119個氨基酸的Pre-S1蛋白。在HBV基因組中，Pre-S/S區基因在所有開放閱讀框中具有較高的突變率，其中主要核心親水區域（major hydrophilic region，MHR）內“α”決定簇（氨基酸位點124～147）基因序列的突變更為常見。目前，大多數文獻認為S蛋白中的“α”決定簇是HBsAg具有免疫原性的區域[4]，其中“α”決定簇的第2個環是HBsAg的主要抗原決定簇[5]。編碼“α”決定簇基因序列的上游和內部往往存在多位點突變和氨基酸替代，均可引起抗原構象變化，影響中和抗體的識別。Pre-S/S蛋白突變也會影響病毒的分泌和穩定性，導致循環中病毒量出現低水平。由于上述原因，Pre-S/S區突變會影響體內HBV的清除，從而影響機體免疫反應，使HBV產生免疫逃逸現象，同時還會干擾體外診斷試劑的檢測。因此，研究和分析HBV病毒株S區基因MHR常見的突變類型，對于HBV疫苗的研制、乙肝的預防和治療監測、輸血的安全性等都有重要意義。

1 我國HBV S區基因組MHR常見的突變及氨基酸替換

HBV S區基因組MHR編碼的“α”決定簇富含半胱氨酸，由C124和C137、C139和C147兩兩間的二硫鍵形成2個環形結構，共同維持著HBsAg的構象結構和抗原性。因此，發生在“α”決定簇的單個或多個點突變均可能導致HBsAg的構象和抗原性發生改變。世界各地已廣泛報道，慢性乙肝患者感染的HBV常在MHR出現突變，形成突變逃逸株。然而，突變的頻率在各個國家不盡相同。在我國，MHR的突變率同樣存在明顯的地域性差異。LI等[6]對我國廣東省東莞地區HBV感染患者MHR變異導致的氨基酸替換進行了研究，結果發現391例慢性HBV感染者中91例存在MHR的氨基酸替換（突變率為24.6%），其中在“α”決定簇內的有48例（突變率為52.7%），發生突變的主要位點為S126、S100、S101、S133、S145、S120、S129。SHI等[7]調查了我國華北地區HBV流行株S基因MHR突變率，發現HBV基因MHR的總體突變頻率為46.6%，顯著高于LI等[6]的研究結果；其中突變頻率高的位點有Q10I（29.9%）、I126T（70.6%）。I126T突變是HBV的C基因型獨有的，且頻發于我國HBV感染患者。該位點位于“α”決定簇第1個環形結構，其氨基酸改變會導致抗原性的改變，并使HBV毒力增強，這與美國和西歐國家的HBV變異發生模式和發生類型不同。一項由我國23家醫院參與的臨床研究納入230例未經治療的HBV基因型均為C的乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性患者，結果顯示僅有16.96%的患者感染的HBV S區基因無突變，有83.04%的患者HBV S區基因出現1個或多個位點的突變；這些點突變主要位于“α”決定簇，突變類型有S117T、K122R、I126N/S/T和G145R；同時還發現一些罕見報道的突變位點，如E2G、L21S等；低HBsAg水平患者S區基因突變的頻率顯著高于高HBsAg水平的患者[8]。DING等[9]的研究結果顯示，大約有4.9%的慢性乙肝患者血清中HBsAg和乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）同時存在，這些患者常表現為“α”決定簇內的點突變或Pre-S缺失突變；與HBsAg陽性的常規模式比較，28例HBsAg和HBsAb雙陽性的慢性HBV感染者體內HBV Pre-S區缺失突變更易發生（HBsAg和HBsAb雙陽性的突變率為25.0%，HBsAg陽性常規模式的突變率為3.6%）。他們的研究結果還顯示，血清HBsAg和HBsAb雙陽性患者體內HBV S蛋白的N-末端和MHR出現高頻突變，尤其在“α”決定簇存在較多的氨基酸替換，最常見的位點為S126。

HBV的隱匿性感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）特指患者血清HBsAg陰性，HBsAb、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）等陽性，可檢測到低水平HBV DNA（一般＜200 IU/mL）或肝組織檢測出HBsAg或乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）。許多實驗和臨床研究均證實OBI具有傳染性，可通過再激活、輸血或器官移植等發展成典型的乙肝，最終發展為慢性乙肝、肝硬化和肝細胞性肝癌。OBI發生的機制還未完全清楚，HBV低水平復制、抗原表達量低、HBV基因變異、宿主免疫應答異常等均可導致OBI。最受關注的是HBV S區基因的變異，導致檢測結果出現假陰性。我國是HBV的高流行國，很多學者對OBI與HBV S區基因變異的關系進行了大量研究。郭燕等[10]研究了38例OBI患者，其中8例完成了HBV Pre-S/S區基因測序；OBI毒株MHR中氨基酸的變異率顯著高于野毒株，在“α”決定簇檢測到I126T、Q129R、M133T、F134I、D144E和G145K突變。黃象艷等[11]研究了10例OBI慢性乙肝患者，8例患者感染的HBV存在不同S區基因的突變或突變株與野生株的混合感染；突變頻率較高的位點為T47A、L98V、I/T126N/S、T131N、M133T/I等。LIAO等[12]的研究結果顯示，在陜西省寶雞地區獻血者中OBI約占0.054%；對43例OBI患者的HBV Pre-S/S區基因進行分析，發現OBI毒株MHR的突變率顯著高于慢性乙肝病毒株；突變位點主要見于S117T、T118K、T131N、 T134Y/L和D144E，Pre-S區還出現＞33個堿基對的缺失。

2 臨床常用HBsAg檢測試劑的不足

我國HBsAg的檢測方法主要為酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CIA）。ELISA試劑盒大部分可用于血液HBsAg的篩查，檢測敏感性已較高。由于檢測方法主要采用雙抗體夾心法，作為檢測抗體和捕獲抗體的HBsAb主要的結合位點是HBsAg的“α”決定簇。因此，“α”決定簇內的氨基酸置換可引起HBsAg蛋白的構象發生變化，使檢測抗體或捕獲抗體與變異的HBsAg結合力降低或無法識別，造成漏檢。HUANG等[13]采用國內常用的檢測HBsAg的4種ELISA試劑（新創、科華、萬泰和Murex）和2種主流CIA（雅培和羅氏）檢測7例疑似OBI的慢性乙肝患者血清，這4種ELISA試劑均為輸血篩查試劑，與CIA一樣，具有較高的檢測敏感性。他們的研究結果顯示，7份樣本用新創試劑檢測均為陰性，科華和萬泰的試劑檢測僅1份陽性，Murex試劑檢測有5份樣本陽性；用雅培CIA檢測有3份樣本陽性；用羅氏CIA檢測7份樣本均為陽性。由此可見，HBsAg檢測試劑的敏感性和對變異抗原的識別捕獲能力在檢測HBsAg中非常重要。國產ELISA試劑盒與同為ELISA原理的Murex試劑相比，存在一定的差異。藍海云等[14]使用adw、adr和ay 3種國家參考物質及真核表達的分別含G144A、Q129R/M133T、T118K/P120Q和G145R 4種變異的HBsAg作為檢測樣本，評價了14種HBsAg檢測試劑盒（6種進口、8種國產）對野生型和突變型HBsAg的檢測能力。他們的研究結果顯示，對于野生型HBsAg，國產和進口試劑的檢測能力無差異；對于血清型adw和adr，國產試劑的檢測低限已達0.1 IU/mL；對于血清型ay，國產試劑的檢測低限已達0.2 U/mL；對于Q129R/M133T突變型HBsAg，國產試劑的敏感性與進口試劑相差20倍以上；國產試劑對T118K/P120Q突變HBsAg出現漏檢，且進口試劑的敏感性高于國產試劑；國產試劑和進口試劑對G145R突變HBsAg的敏感性一致。進口ELISA試劑對于突變HBsAg的檢測敏感性高于進口CIA試劑；國產試劑對于突變HBsAg的檢測能力需進一步提高。YANG等[15]采用10種商品化HBsAg試劑盒檢測了1份來自獻血者的血樣，10種ELISA試劑盒中有8種檢測結果為陰性，HBV DNA測序分析發現在S區出現2個天然突變位點，即nt 353A變為T和nt 349T變為A，導致氨基酸出現T118M和K122N替換；進一步分析發現是T118M的氨基酸替換造成了8種商品化ELISA試劑盒檢測HBsAg的漏檢；將該突變氨基酸恢復后，也恢復了這8種ELISA試劑盒的檢測能力。

3 造成HBsAg漏檢的可能機制和原因

目前，學者們認為導致HBsAg漏檢的原因是多方面的，其中最主要的原因是HBV Pre-S/S區基因的突變。

3.1 HBV Pre-S/S區基因突變和氨基酸置換導致HBsAg的抗原性及表達降低

“α”決定簇內或臨近單個或多個序列位點的變異均可引起HBsAg構象表位發生改變，從而影響抗原和抗體的結合反應[16]。S126是最常見的Pre-S/S區突變位點。現已證實T126S突變導致的氨基酸置換可明顯降低HBsAg的抗原性，導致HBV出現免疫逃逸和HBsAg漏檢[6]。S145位點突變的流行率為2.3%，包括G145R和G145A[6]。G145R突變是目前研究最多、報道最廣泛的Pre-S/S區突變。G145R突變能改變“α”決定簇內的環狀結構，使相應的抗體不能被充分識別[17]。ZHANG等[18]使用9個HBV S區基因突變載體轉入真核細胞載體，轉染Huh7或HepG2細胞，結果顯示轉染I/T126V伴G145R、氨基酸122-123位插入K-S-T-G-L-C-K短肽伴G129N突變體細胞的上清液中未檢出HBsAg，轉染I/T126V和Q129N伴G145R突變體的上清液中HBsAg水平顯著下降；這些突變體表達的融合蛋白的抗原性僅為1.66%～63.83%，明顯低于野生型。S133的突變率約為2.8%，存在3種突變類型：M133L、M133T和M133S；其中M133L僅在HBV的B基因型中被發現，M133S則存在于C基因型中，M133T突變可產生新糖基化位點T131N，新糖基化位點通過模擬B細胞表位的作用干擾HBsAg的識別[19]。有研究結果顯示，G145R突變可以明顯降低HBV的復制、減少HBsAg的表達，從而影響對HBsAg的檢測[20]。使用定點突變技術構建G145A突變體并轉染Huh7和HepG2細胞，與野生型相比較，轉染G145A突變體的細胞上清液中的HBsAg水平顯著降低[21-22]。ZHANG等[18]的研究結果顯示，轉染I/T126V突變體或I/T126V伴G145R突變體的細胞內和上清液中的HBsAg水平均明顯低于野生型，而轉染Q129N伴G145R突變體HBsAg水平僅中度降低。

3.2 HBV基因組Pre-S/S區突變和氨基酸置換對HBsAg分泌的影響

XIANG等[8]的研究結果顯示，HBV基因組Pre-S/S區E2G、L21R、G24K、T47A/K、C69stop、L95W、L98V和G145R突變與HBsAg水平呈負相關；與野生型相比，E2G、C69stop、L95W、L98V和G145R突變使細胞外HBsAg水平顯著降低，而細胞內HBsAg水平僅稍有降低；然而，突變型轉染細胞的HBV總RNA和未轉染前基因組RNA水平與野生型無明顯差異。由此可見，Pre-S/S區突變引起的氨基酸置換未影響HBsAg轉錄，但HBsAg分泌受損。W172R和W182L突變型幾乎可完全阻滯內質網分泌HBsAg[23]。T118K、 K141E、D144G、C147R和C149R突變可嚴重損傷HBV的分泌[24]。

3.3 HBV基因組可整合到宿主染色體中

HBV侵入人體后將基因組整合到宿主DNA上，約有75%以上的OBI肝細胞癌（HCC）或HBsAg陽性HCC患者在染色體DNA中發現整合的HBV DNA，其常以不完整的DNA片段整合到宿主DNA的不同位置，以HBV X基因和Pre-S/S序列為多見；這種整合破壞了HBV和宿主基因組的完整性，導致HBsAg不表達或無法被識別[25-26]。

3.4 HBsAg檢測試劑的敏感性

目前，國產HBsAg試劑盒的敏感性準入標準已經達到0.5 ng/mL，進口CIA試劑已達到0.2 ng/mL。HBsAg檢測的敏感性與待檢樣本中HBV的基因型和血清型密切相關，不同亞型間的檢測敏感性可相差10倍以上[24]。盡管目前國產試劑對HBsAg的檢測敏感性在不斷提升，但對于Pre-S/S區突變抗原的檢測能力仍需進一步提高。

4 問題與展望

HBV Pre-S/S區突變導致的HBsAg漏檢對于輸血安全及乙肝診斷、治療評估等的危害性是不言而喻的。發生突變的HBV易產生免疫逃逸。易引起漏檢的“熱點”突變位點的發現及其病理生理機制的闡明，為改進HBsAg檢測試劑的分析性能奠定了基礎。目前，對于廣泛報道的S145位點突變已研究得較為深入，大部分HBsAg檢測試劑盒已能捕獲此類型的突變株。但還應針對我國流行的HBV Pre-S/S區突變“熱點”位點，如S120、S126、S129等加大力度研發檢測試劑，同時提高檢測的敏感性，以減少HBsAg的漏檢。