自噬在胰腺癌發生及治療中的作用研究進展

侍書成，楊波

（蘇州大學第三附屬醫院肝膽外科，江蘇常州213003）

自噬是真核細胞降解細胞內大分子物質和受損細胞器的過程，具有廣泛的生物學作用。作為細胞內的一種自我防御機制，自噬可通過調節能量代謝和蛋白質或細胞質量控制等方式穩定細胞內環境和維持細胞正常功能。自噬的異常與感染、免疫、衰老、腫瘤、神經變性疾病等多種疾病的發生發展有關，其中，自噬與腫瘤的關系備受關注。自噬在腫瘤的發生、發展過程中發揮雙向調節作用，既可對腫瘤細胞產生抑制作用，又可促進其發生和發展。本文就自噬及其與胰腺癌之間關系的研究進展進行綜述。

1　自噬的分類與過程

自從1963年Deter和De Duve［1］首次提出自噬這一概念以來，自噬的發生機制已得到大量研究闡明。按照發生過程的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。巨自噬是最常見也是最主要的自噬形式。通常認為內質網是自噬體膜的重要來源，電子斷層掃描已證實內質網與自噬體之間存在關聯［2］。也有研究認為線粒體、細胞膜、核膜、高爾基體等是自噬體膜的來源。但是由于這些結構形成自噬體過程中缺乏特異性的蛋白標志物，使得自噬體膜的來源問題仍未明確［3］。

自噬起始階段，在起始信號如饑餓、缺氧刺激下，調控自噬的中心分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性受到抑制，mTOR對 Unc-51樣激酶（Unc-51-like kinase 1，ULK1）的磷酸化作用減弱，使ULK1激活并進一步活化 ULK 1復合體——ULK 1／2-Atg13-FIP200-Atg101。隨后ULK1復合體從細胞質定位到內質網特定部位進而募集VPS 34復合體，VPS 34通過磷酸化磷脂酰肌醇產生1，2-棕櫚酰磷脂酰肌醇-3-磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P）。PI3P是構成自噬體膜的基礎，可組裝一些含有FYVE和PX結構域的蛋白或自噬相關蛋白Atg至自噬體形成部位，啟動自噬體的形成過程。自噬過程中，VPS 34結合VPS 15而被激活并組成VPS 34復合體的核心，此時Beclin1從Beclin1／Bcl2復合體中的非激活狀態解離為激活狀態，參與組成VPS 34復合體。Beclin1可進一步募集Atg 14和抗紫外線輻射相關基 因 （UV irradiation resistance-associated gene，UVRAG）蛋白至 VPS 34復合體［4］，促進自噬體的形成、成熟和運輸。而 VMP 1，Ambra-1，Bif-1，Rubicon等也可參與構成VPS 34復合體，對自噬體的形成起正性或負性調節作用。此外，當細胞處于低ATP狀態時，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）也可感受胞內AMP水平，通過磷酸化激活 TSC1／TSC2（tuberous sclerosis complex proteins）復合體來抑制mTOR或直接磷酸化ULK 1促進自噬［5］。

在自噬體延長階段，微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）起到了關鍵作用。細胞中LC3前體經Atg4切割顯露出C末端甘氨酸殘基形成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ再經Atg7和Atg3活化，在Atg5-Atg12-Atg16L1組成的Atg16復合體作用下形成具有膜結合力的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是自噬中特異性最強的標志物，在Atg16復合體與LC3-Ⅱ的協助下，自噬體膜泡延長、包裹待降解內容物直至形成閉合的含雙層膜結構的成熟膜泡。最后自噬體運輸至溶酶體，在溶酶體中水解酶的作用下降解包裹的內容物。

2　胰腺癌中自噬的上調及其意義

Réz等［6］在 1999年首次報道胰腺癌中的自噬現象。他們在藥物誘導的胰腺癌動物模型中發現，在正常腺泡上皮向非典型腺泡上皮轉變過程中自噬活動也逐漸增加。隨后的一個對71例胰腺癌患者的回顧性研究中，免疫組化檢測結果顯示自噬相關蛋白LC3在未接受化療的胰腺癌患者癌組織周邊顯著增加，且LC3表達增加與患者的不良預后密切相關［7］。胰腺癌中LC3的上調標志著自噬激活，且自噬是細胞內一個不斷變化的動態過程。LC3的上調可以理解成自噬流的活化，也可能是自噬的后半進程（如自噬溶酶體降解）受阻的表現，所以單從LC3水平推測自噬活性并不能明確兩者間功能相關性。Yang等［8］采用GFP-LC3標記法和免疫組化染色法，發現胰腺癌細胞系中LC3-Ⅱ和自噬相關蛋白Atg7的表達明顯高于正常胰腺導管細胞。進一步用電子顯微鏡也觀察到胰腺癌細胞中自噬體與溶酶體的融合過程。與單純檢測個別自噬相關標志相比，通過多種標志物及檢測方法來檢測自噬水平，能更準確反映細胞內自噬的動態激活。他們還發現胰腺癌轉移的淋巴結和浸潤的神經纖維中也存在高強度LC3染色。以上研究提示異常的自噬參與胰腺癌的發生發展過程，甚至腫瘤的轉移，并可能影響胰腺癌的預后。

3　單純抑制自噬與胰腺癌的關系

Kim等［9］研究發現，營養缺乏狀態可通過抑制mTOR誘導胰腺癌PANC-1細胞自噬水平的升高，當用自噬抑制劑氯喹（抑制自噬溶酶體的降解）或渥曼青霉素（抑制自噬體的形成）抑制自噬后，胰腺癌細胞的存活率降低。同時，免疫組化染色發現經氯喹與渥曼青霉素處理后，腫瘤細胞中caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶顯著升高，且caspase抑制劑Z-VAD可部分抑制氯喹與渥曼青霉素引起的細胞死亡。這些證據表明，自噬可作為一種細胞保護反應，通過抗凋亡機制促進胰腺癌細胞存活。氯喹與渥曼青霉素可通過抑制自噬促進腫瘤細胞凋亡。其他研究也表明抑制自噬可以促進細胞凋亡，如特異性的神經元敲除Atg5或Atg7，可引起小鼠神經元退化和凋亡［10］。

Yang等［8］研究發現氯喹或Atg5 siRNA阻斷自噬后，胰腺癌細胞內氧消耗和氧化磷酸化水平降低，細胞增殖受到抑制，與之伴隨發生的是細胞內ROS水平的升高以及DNA雙鏈斷裂片段增多。而ROS抑制劑（抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸）可明顯降低胰腺癌細胞內的自噬水平和部分減輕因自噬抑制造成的腫瘤細胞的增殖抑制。這提示自噬可通過抑制胰腺癌細胞內ROS的生成，維持細胞內DNA的穩定，從而起到對腫瘤的保護作用。同時他們還發現自噬可提供三羧酸循環所需的中間代謝物，從而維持細胞內能量代謝平衡。

自噬可通過抑制凋亡、減少ROS生成來維持基因組穩定和能量代謝平衡以促進胰腺癌的發生發展。因此，通過抑制自噬來影響腫瘤生物學行為的研究也逐漸成為抗胰腺癌治療的熱點。其中關于自噬抑制劑氯喹及其類似物羥氯喹的研究較為突出。但Wolpin等［11］的研究顯示，羥氯喹單藥治療胰腺癌并不能達到普遍的自噬抑制效果，因此認為單獨抑制自噬或許不足以抑制人體胰腺癌的生長。

此外，自噬在腫瘤中扮演的角色，不僅取決于腫瘤的類型和發展階段，還取決于腫瘤的基因譜。胰腺癌的發展往往伴隨基因突變，其中Kras突變出現在幾乎100%的胰腺癌中，約75%的胰腺癌伴有p53缺失或突變［12－13］。Rosenfeldt等［12］對基因工程小鼠模型的研究發現，小鼠胰腺Kras突變（G12D位點突變，KrasG12D／＋）誘導了自發性癌前損害——Pan-INs。隨著時間的推移，PanIN經歷PanIN-2、PanIN-3逐步發展至胰腺癌。然而當敲除自噬相關基因Atg 7或Atg 5時，小鼠只發生PanIN-1和少量的PanIN-2，而形成PanIN-3和胰腺癌的過程卻受到阻礙。這表明Kras突變（p53正常）誘導發生的胰腺癌需要自噬的參與。然而構建 KrasG12D／＋、p53－／－小鼠模型發現，敲除Atg 7組的小鼠死亡時間明顯快于未敲除組，而且Atg7的缺失加快了腫瘤形成。因此，胰腺癌的發展過程中，自噬所起的作用受到p53基因的調節：當胰腺癌中p53未發生缺失或突變時，自噬促進腫瘤發展，而當p53發生缺失或突變，自噬抑制腫瘤的發展。與Yang等［8］的研究結果不同，Rosenfeldt等［12］采用羥氯喹處理Ras誘導的p53缺失胰腺癌小鼠時，羥氯喹不但未顯示腫瘤抑制作用，反而加快了腫瘤的生長并明顯縮短了小鼠生存期。所以，應用羥氯喹時應重視腫瘤基因突變譜，尤其伴有p53突變的腫瘤，其抗腫瘤效應尚待進一步研究。雖然Rosenfeldt等［12］對氯喹或羥氯喹應用于臨床的安全性提出了質疑，但是Yang等［14］認為在眾多腫瘤發展過程中，野生型p53等位基因的雜合性缺失（而不是純合性缺失）誘導了胰腺癌的發生。他們在體外培養3種不同 p53基因型 （p53＋／－，p53－／－和p53R172H／＋）的小鼠胰腺癌細胞系，當通過敲除Atg5或采用氯喹抑制自噬時，這3種細胞系的克隆均受到抑制，即無論p53是否發生突變或缺失，抑制自噬對腫瘤的生長均起到抑制作用。更重要的是，羥氯喹還可有效抑制小鼠體內人胰腺癌移植瘤的生長，而這些移植瘤均伴有Kras和p53突變。這種矛盾的研究結論可能是由二者運用的小鼠模型不同造成，所以建立的動物模型不同會影響研究結果。

4　自噬與胰腺癌化療

許多化療藥物可提高腫瘤細胞內的自噬水平，其機制可能包括：通過激活p53，繼而增加自噬相關蛋白（如 AMPK，DAPK1，TSC2，ULK1／2）表達以促進自噬活性［15］；通過增加 Beclin-1、VMP1的表達或促進Vps34的激活以誘導自噬發生［16］。根據細胞類型的不同，具體作用機制也存在差異。自噬水平的升高既能促進也能拮抗化療藥物的抗腫瘤作用。在胰腺癌的化療實驗中也存在類似的現象。

4.1　自噬促進化療藥物的抗胰腺癌作用

Mukubou等［17］用吉西他濱處理胰腺癌細胞，細胞內自噬水平提高，當吉西他濱聯合放療后，自噬水平得到進一步提高。當用低劑量3-甲基腺嘌呤短時間處理胰腺癌細胞時，既能有效抑制自噬，又不會影響腫瘤細胞增殖。在用該劑量的3-甲基腺嘌呤聯合吉西他濱處理胰腺癌細胞時，吉西他濱的IC50升高，表明抑制自噬能減弱吉西他濱的抗腫瘤作用。Pardo等［18］也證實，吉西他濱可以通過VMP1上調胰腺癌細胞內自噬而促進細胞凋亡，當用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，吉西他濱的促凋亡作用明顯減弱。Fiorini等［19］發現豹蛙酶（onconase）可通過 Beclin-1提高胰腺癌細胞內自噬水平，從而誘導胰腺癌細胞的凋亡和生長抑制，氯喹和3-甲基腺嘌呤可明顯減弱豹蛙酶的促凋亡和生長抑制作用。而豹蛙酶誘導自噬的同時增加了細胞內ROS生成，與Yang等［8］的研究結果不同，升高的ROS卻可通過激活Akt／mTOR通路對自噬產生拮抗作用，從而逃避豹蛙酶誘導的自噬性死亡。更重要的是，豹蛙酶和吉西他濱聯合應用可明顯增強吉西他濱的促凋亡和生長抑制作用，且聯合用藥可減少吉西他濱的劑量及其導致的毒副反應。

雖然大量體內外實驗均顯示，單純應用自噬抑制劑（氯喹、羥氯喹或3-甲基腺嘌呤）可抑制胰腺癌的生長［8－9，14］，但當抗腫瘤藥物引起腫瘤細胞內自噬水平進一步升高時，此時抑制自噬卻可促進腫瘤的存活［17－19］。所以可認為胰腺癌細胞內基礎水平的自噬較正常胰腺細胞高，對于腫瘤細胞來說，其已適應該水平的自噬，且該水平的自噬可通過提供營養物質和能量維持腫瘤生長，但是當受到化療藥物等應激刺激時，腫瘤細胞內會產生更高水平的自噬作為對應激刺激的初級應答，隨后過度激活的自噬可能觸發細胞凋亡。

4.2　自噬抑制化療藥物的抗胰腺癌作用

化療藥物誘導的自噬既可觸發腫瘤細胞凋亡，也可作為腫瘤細胞抗凋亡的促生存機制。Hashimoto等［20］發現吉西他濱和5-氟尿嘧啶在抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖的同時可誘導細胞內自噬水平升高，氯喹可明顯增強吉西他濱或5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞生長的抑制作用。他們認為，細胞內激活的自噬作為對化療藥物的防御機制起到了細胞保護作用，而不是促凋亡作用。另外，腫瘤組織中腫瘤干細胞的殘留增加了腫瘤治療后復發的風險，且胰腺癌中腫瘤干細胞含量增多與腫瘤的化療抵抗、遠處轉移和不良預后有關［21－22］。除了胰腺癌細胞，胰腺癌干細胞中自噬水平也顯著升高，這有助于腫瘤干細胞在缺氧環境中的存活［23］。Yang等［24］發現用基因敲除或氯喹等手段抑制自噬后，胰腺癌腫瘤干細胞和胰腺癌細胞的生長均受到明顯抑制，小鼠體內移植瘤生長也明顯被抑制。這表明與胰腺癌細胞相似，腫瘤干細胞同樣需要自噬維持自身的活動。更重要的是，當用氯喹或基因敲除抑制自噬后，吉西他濱對腫瘤干細胞及小鼠體內移植瘤的生長抑制作用明顯增強。

然而，氯喹也可通過非自噬依賴性通路對腫瘤干細胞產生抑制作用。趨化因子C-X-C chemokine ligand 12（CXCL12）及其受體CXCR4組成的信號轉導通路與腫瘤的生長、侵襲、轉移密切相關［25］。胰腺癌中CXCL12／CXCR4通路扮演著重要的角色，CXCR4表達陽性的上皮性腫瘤干細胞可順濃度梯度遷移至CXCL12高表達的器官（如肺、骨、肝臟等）［26］。Hedgehog信號通路在維持腫瘤干細胞自我更新、轉移中發揮重要作用［27］。Balic等［28］的實驗顯示，低濃度氯喹可抑制胰腺癌細胞系的自噬，但是對腫瘤干細胞的自噬無明顯影響。體內、外實驗均已證實，氯喹可同時減少細胞膜表面CXCR4的表達和Hedgehog通路中PTCH、SMO、GLI1等蛋白的表達，從而抑制 CXCL12／CXCR4和 Hedgehog兩條通路介導的腫瘤細胞增殖、遷移及其在肝臟的定植。對乳腺癌和結腸癌的研究顯示，自噬可拮抗5-氟尿嘧啶誘導的細胞周期阻滯作用，氯喹可通過激活抑癌基因p53及其下游基因p21、p27而誘導G1期細胞周期阻滯，從而增強 5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用［29－30］。由此可見，不同藥物可通過不同機制上調細胞內自噬，而自噬又可通過不同機制對藥物起反作用。

5　結論與展望

自噬在胰腺癌發展及治療中扮演著復雜的角色，盡管單純抑制自噬可抑制胰腺癌細胞生長，但當自噬抑制劑聯合化療藥物抗腫瘤時，卻產生了相反的作用。這種現象與自噬抑制劑的非特異性作用及其與化療藥物的不同作用機制有關。所以，探索自噬特異性抑制劑并闡明其與其他抗腫瘤藥物在胰腺癌中的相互作用機制，將為胰腺癌的臨床治療提供新的方法及思路。

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