蛤蚧肽藥理活性及其分子鑒定技術研究

張 宇，林 賀，金 平，王 會，張 輝*，孫佳明*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林農業大學，長春 130118）

蛤蚧（gekko gecko linnaeus），又名仙蟾、大壁虎等。屬于脊索動物門Vertebrata，爬行綱Reptilia，有鱗目Squamata，守宮科Geckonidae動物蛤蚧Gekko gecko除去內臟的干燥體，主要產于廣西、云南、貴州等省區[1]。蛤蚧除了作為傳統中藥有藥用價值外，還具有保健食品功能，功效為補腎益肺、納氣定喘、助陽益精[2]。目前對蛤蚧成分研究主要集中在活性成分如功能蛋白質、性激素樣化合物、脂類等。蛤蚧蛋白能夠調節腫瘤及化療藥物所造成的免疫功能抑制的作用[3]。目前市場上蛤蚧用量不斷擴增，中藥來源逐年縮減，偽混品常參在蛤蚧藥材中，現已出現蛤蚧偽品多達18種[4]。因此本文總結了從DNA分子水平對傳統中藥蛤蚧及其偽混品的鑒定研究進展，為蛤蚧的蛋白組分研究以及藥材的準確鑒定提供參考。

1　分子水平鑒定

1.1細胞色素C氧化酶I亞基基因（COI）條形碼序列 DNA條形碼鑒別技術，能夠達到在利用不同個體所含不同DNA來鑒別藥材的真偽度[5]。張紅印[6]構建COI序列對比以及鄰接（NJ）樹。通過鑒定蛤蚧藥材和混偽品壁虎等共11個物種，103份樣品，所構建的NJ樹中真品單獨聚在一支，能夠準確與其混偽品區分。壁虎和蛤蚧雖為同科屬動物，但二者的性狀有很大差別，功效也不相同[7]。包華音等[7]通過應用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術鑒別壁虎和蛤蚧，提取水溶性蛋白質，對其進行等體積PAGE，分析電泳圖譜。結果壁虎和蛤蚧的蛋白質條帶在分布和數量方面存在比較明顯的差異。而且黑蛤蚧和紅蛤蚧，由于地理分布原因導致兩種蛤蚧親緣性較遠，應用隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術，對其進行鑒別，結果顯示遺傳變異比較豐富，區域性很明顯[8]。

1.2COI序列的擴增 在現代研究中利用COI序列鑒定蛤蚧時間稍長，蔣超等[4]建立一種快速PCR鑒別技術，在得到特異性條帶基礎上加入SYBR Green I染料后，365 nm紫外光照射有強烈綠色熒光，偽混品沒有以上兩種特征。該操作可快速鑒定，且在30 min內就能完成。更有研究表明以線粒體 Cytb、COI、12S rRNA、16SrRNA 基因序列為基礎，顧海豐等[9]創建新方法，根據16條COI序列設計了1對位點特異性引物COISF、COISR，同時從Gen-Bank上下載 30 條序列，設計了Cytb SF、Cytb SR，16SrRNASF、16Sr RNASR，12SrRNASF、12SrRNASR這3對位點特異性引物，結果表明正品條帶出現擴增，偽品條帶不擴增。

1.3rRNA基因序列 張月云等[10]研究蛤蚧的兩個類群，黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的種群遺傳變異情況。采用了這兩個類群的6個個體線粒體的12S rRNA基因片斷序列，經過系統學分析后，蛤蚧的2個類群間變異范圍是4.81%～6.73%；偽品壁虎與蛤蚧群間變異指數是30.44%～35.69%。經此研究得到，黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的暫且不能作為蛤蚧的兩個亞種。

2　蛋白組分

2.1蛤蚧的蛋白質、肽、氨基酸 目前，國內外研究中藥蛤蚧十分火熱，蛤蚧的活性成分主要有3種，醇溶性物質，水溶性物質，脂溶性物質。醇溶性部分包括脯、谷、丙、精、天門冬、絲、賴等18種氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酸含量最高；水溶性部分包括鈣、磷等無機元素；脂溶性部分包括磷脂、糖脂等脂類。經提取分離得到的蛋白質、肽和氨基酸類，不僅在疾病治療以及預防方面有重要作用，而且在保健功能上也有突破。且蛤蚧醇提取物有良好的抗感染、調節脂質代謝、保護肝功能作用明顯。在保健方面也有增強免疫，強身健體，延緩衰老等作用。蛤蚧中人體必需氨基酸含量豐富，占總量的30%～45%。龔千鋒等[11]對蛤蚧身體各部進行氨基酸含量的分析結果表明：其體部和尾部所含氨基酸的加和量最高，分別為 570.18 mg/g 和 566.04 mg/g；頭部所含氨基酸的加和量低于體部、尾部，排第三；爪部所含氨基酸的加和量排第四；眼部所含氨基酸加和量為最低。但組氨酸、色氨酸含量低于各部位均值[12]。蛤蚧尾部氨基酸含量高于軀干部，其中作為機體的第一限制性氨基酸，賴氨酸的含量高138倍[12-13]。另還分離出一種多肽，具有抗感染活性。

2.2蛤蚧肽的藥理活性

2.2.1抗感染、調節脂質代謝 非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的病理綜合征，當前中藥蛤蚧在NAFLD疾病方面研究火熱。潘磊等[14]以高脂飼料法復制NAFLD小鼠模型，以灌服復方蛋氨酸膽堿溶液為對照藥，蛤蚧組小鼠各亞組分別灌服高中低劑量蛤蚧肽溶液。以8周為觀察期，記錄各組小鼠干預前后脂代謝、肝功能及炎性因子指標變化差異。各組小鼠MDA水平均同干預前對比無統計學意義；除空白對照組及模型組小鼠各檢驗指標較干預前無明顯變化外，其余組小鼠TG、TC等脂代謝指標，ALT、AST等肝功能指標及IL-6、TNF-α等炎性因子指標均較干預前顯著降低，SOD水平則顯著提升；低劑量組各指標變化幅度均小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠；中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統計學意義。

2.2.2免疫調節 哮喘嚴重威脅人類健康，發病率幾十年來一直呈上升趨勢。目前普遍認為免疫失調是引發該病的重要原因。蛤蚧能明顯延長豚鼠的引喘潛伏期，顯著抑制哮喘反應，表明蛤蚧具有良好的平喘作用[15]。班建東等[16]以卵清蛋白致敏方法建立BALB/c小鼠過敏性哮喘模型，給予黑斑蛤蚧粉干預治療。以肺組織病理變化，百分比以及IgE水平為指標。結果肺組織炎癥改變不明顯；嗜酸性粒細胞占白細胞總數百分比以及IgE水平顯著低于實驗對照（P＜0.05）。廖成成等[17]以酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中IL-4、IL-5、IFN-γ水平為指標，黑斑蛤蚧能下調小鼠血清中的IL-4、IL-5水平（P＜0.05） ，同時上調 IFN-γ水平（P＜0.05）。作用機制可能是黑斑蛤蚧通過雙向調節 Th1 /Th2 失衡，從而抑制哮喘氣道炎癥。

中藥蛤蚧具有抗腫瘤作用，其機制也是眾多專家的研究熱點。李蕾等[13]提取并分離出不同分子量的蛤蚧蛋白組分，采用MTS法觀察到分離出的3種蛤蚧蛋白組分都具有不同程度地抑制HepG-2細胞生長的作用，其中分子量為3～20 kD的蛤蚧蛋白組分抑制作用最強，且具有劑量依賴性。Hoechst 33342 /PI雙熒光染色法檢測出3～20 kD蛤蚧蛋白作用后壞死細胞和凋亡細胞均增加，RT-PCR法檢測出3～20 kD蛤蚧蛋白組分作用后c-myc基因mRNA表達水平稍降低，p53基因mRNA表達水平升高，但兩者差異均無統計學意義，Bax基因mRNA表達水平明顯增高，差異有統計學意義，Bcl-2基因在蛋白作用前后均無表達。

2.2.3性激素樣作用 蛤蚧肽具有抗衰老作用。蔣興偉等[18]研究蛤蚧乙醇提取液對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，使用TUNEL 和 PI、Annexin V / PI 3種方法檢測卵巢顆粒細胞凋亡率，結果證實3月齡和6月齡實驗組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡均明顯少于對照組。說明蛤蚧乙醇提取液[19]能有效抑制大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，從而改善大鼠卵巢功能，并可能由此延緩大鼠卵巢的衰老。

3　小結

蛤蚧作為傳統中藥，藥效好，臨床療效高。蛤蚧有效成分眾多，但是對于水溶性成分多肽以及蛋白質類成分的藥理活性研究較少，以及蛤蚧肽的具體作用機制還有待研發。目前市場上的蛤蚧偽混品較難分辨，為達到快速鑒定的目的，應用分子生物學技術，在分子水平上進行鑒定，為動物藥快速、現場鑒定提供了技術保障。