響應面法優化金蟬花多糖提取工藝及抗氧化活性分析

宋佳敏，王鴻飛*，孫 朦，王凱凱，許 鳳，邵興鋒，李和生

（寧波大學食品科學與工程系，浙江 寧波 315211）

金蟬花（Cordyceps cicadae）亦稱蟬花、蟬蛹草、蟬茸草，為麥角菌科真菌蟬草及其寄主山蟬的幼體干燥體，屬蟲草類藥食兩用真菌，主要分布于浙江、安徽、四川、福建等地。據報道，金蟬花作為優質蟲草，其活性成分與冬蟲夏草相似[1]，有望成為冬蟲夏草的替代品，近年來受到許多學者的關注。金蟬花主要活性成分為多糖、核苷、甘露醇、麥角甾醇等[2-3]，其中多糖為其主要有效成分。

多糖類化合物廣泛存在于動植物細胞膜和細胞壁中，主要由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，被稱為構成生命的四大基本物質[4]。研究發現，金蟬花多糖具有抗腫瘤[5]、降血糖[6]、免疫調節[7-9]和抗驚厥[10]等重要作用。采用水提法探索金蟬花多糖較適宜的提取工藝條件，并研究金蟬花多糖的抗氧化活性，為金蟬花多糖的開發及綜合利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金蟬花產自浙江紹興。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、濃硫酸（均為分析純） 和光純藥工業株式會社；羥甲基氨基甲烷（Tris） 臺灣生工有限公司；茯苓多糖口服液（國藥準字B20050015） 湖南補天藥業有限公司；蒽酮、葡聚糖、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氫化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Cary 50 Scan紫外分光光度計 美國瓦里安技術（中國）有限公司；WK-200B高速藥物粉碎機 山東青州市精誠機械有限公司；H1650型高速臺式離心機長沙湘儀離心機設備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；FD-ID-80冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司；UH-S2超聲波儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金蟬花多糖的提取

參考楊娜等[11]方法：金蟬花→烘干→粉碎過篩（40目）→加水攪勻→超聲波輔助處理→熱水浸提→過濾→濃縮→Sevag法去蛋白[12]→醇沉→冷凍干燥→金蟬花粗多糖。

1.3.2 金蟬花多糖含量測定

參考張惟杰等[13]硫酸-蒽酮法，以葡聚糖為標準品，繪制標準曲線，并測定樣品多糖含量。

1.3.2.1 標準曲線的繪制

配制質量濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的葡萄糖溶液，分別取1 mL于各試管中，加4 mL硫酸蒽酮溶液反應，迅速放入冰水中冷卻，沸水浴10 min，取出放入自來水中冷卻10 min，以蒸餾水代替葡萄糖溶液為空白對照，在620 nm波長處測定其吸光度。繪制標準曲線得回歸方程y=0.007 9x＋0.008 2，R2=0.998 3。

1.3.2.2 金蟬花多糖含量的測定

準確稱取按1.3.1節方法得到的金蟬花粗多糖粉末，配得質量濃度為1 mg/mL的粗多糖溶液，取1.0 mL樣品溶液加入4 mL硫酸蒽酮溶液，按1.3.2.1節方法測得吸光度，根據公式（1）計算金蟬花多糖含量：

式中：W為金蟬花多糖含量/（mg/g）；C為樣品溶液多糖質量濃度/（μg/mL）；V為樣品定容體積/mL；m為原料質量/g。

1.3.3 單因素試驗

按照1.3.1節的方法分別考察超聲功率（60、90、120、150、180、200 W）、超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）、浸提溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）、浸提時間（30、60、90、120、150、180 min）以及液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g））5 個因素對金蟬花多糖提取的影響。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，確定超聲波輔助處理的功率和時間，對其余3 個因素利用響應面分析法對提取工藝條件進行進一步的優化。根據Box-Behnken試驗設計原理[14]，選取浸提時間（A）、浸提溫度（B）、液料比（C）3 個因素為自變量，以金蟬花多糖含量為響應值（Y），進行三因素三水平的響應面試驗分析，得到金蟬花多糖提取的適宜工藝參數。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 金蟬花多糖抗氧化活性實驗

1.3.5.1 金蟬花多糖還原力的測定

樣品還原能力的測定采用普魯士藍法[15]，具體操作參照Pan Yingming等[16]方法：準確吸取1.0 mL不同質量濃度多糖溶液，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應20 min，隨后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應。3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL無水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，于700 nm波長處測定吸光度，平行測定3 次，以VC和茯苓多糖作為對照。測得吸光度越大說明樣品還原力越強。

1.3.5.2 金蟬花多糖清除DPPH自由基能力的測定[17]

分別在不同質量濃度的多糖溶液中加入2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），振蕩混勻，避光靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光度Ai。同時，用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，測得吸光度Aj，并測得2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL無水乙醇混合液的吸光度A0。以無水乙醇為參比，以VC和茯苓多糖作為對照，DPPH自由基清除率按公式（2）計算：

式中：A0為2 mL DPPH-乙醇溶液＋2 mL無水乙醇吸光度；Ai為2 mL DPPH-乙醇溶液＋2 mL樣品溶液吸光度；Aj為2 mL無水乙醇＋2 mL樣品溶液吸光度。

1.3.5.3 金蟬花多糖清除·OH能力的測定

采用Fenton反應體系法[18-19]：分別往試管中加入不同濃度的多糖溶液1.0 mL，再分別加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液和1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，37 ℃水浴1 h，在510 nm波長處測定其吸光度Ai。用蒸餾水代替樣品溶液測得A0，用蒸餾水代替雙氧水溶液測得吸光度Aj，按照公式（3）計算·OH清除率：

式中：A0為1 mL FeSO4溶液＋1mL蒸餾水＋1mL H2O2溶液＋1mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；Ai為1 mL FeSO4溶液＋1 mL樣品溶液＋1 mL H2O2溶液＋1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；Aj為1 mL FeSO4溶液＋1 mL樣品溶液＋1 mL蒸餾水＋1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度。

參考朱月等[20-21]使用的鄰苯三酚自氧化法：取4.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2，50 mmol/L）于試管中37 ℃水浴預熱20 min，加入4 mL蒸餾水，37 ℃水浴20 min，取出加入0.5 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液37 ℃水浴預熱20 min，計時1 min后迅速搖勻倒入比色皿，以10 mmol/L的HCl溶液作為對照，利用US-Vis Analyst軟件，設置波長為325 nm，測定時間間隔為30 s，測定其吸光度，以時間、吸光度為坐標作圖，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率v0。用4 mL多糖溶液代替4 mL蒸餾水，按上述同樣方法進行實驗，以VC和茯苓多糖作對照，斜率為加有相應濃度樣品溶液的鄰苯三酚氧化速率v1，按公式（4）計算·清除率：

式中：v0為鄰苯三酚自氧化速率；v1為加入樣品溶液作為抑制劑后鄰苯三酚氧化速率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對金蟬花多糖含量的影響

在液料比50∶1（mL/g）、超聲功率150 W、浸提溫度80 ℃、浸提時間90 min條件下，考察超聲時間對金蟬花多糖提取的影響，如圖1所示。

圖1 超聲時間對金蟬花多糖含量的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment time on polysaccharide yield

由圖1可以看出，在超聲時間小于20 min時，金蟬花多糖含量隨著超聲時間的延長而增加；在20 min時，多糖含量較高，此時多糖含量為26.77 mg/g。在超聲時間大于20 min時，金蟬花多糖含量呈現下降，這可能是隨著超聲時間的延長，多糖降解所致[22]。

2.1.2 超聲功率對金蟬花多糖含量的影響

在超聲時間20 min、浸提溫度80 ℃、浸提時間90 min、液料比50∶1（mL/g）條件下，考察超聲功率對金蟬花多糖提取的影響。由圖2可知，超聲功率在60～120 W時，多糖含量隨功率的增加而增加；當超過120 W時，多糖含量隨著超聲功率的增加而下降。當超聲功率為120 W時，多糖含量較高，可達26.72 mg/g。

圖2 超聲功率對金蟬花多糖含量的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.1.3 浸提時間對金蟬花多糖含量的影響

在超聲時間20 min、超聲功率120 W、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1（mL/g）的條件下，考察浸提時間對金蟬花多糖提取的影響。由圖3可知，當浸提時間達到120 min時，金蟬花多糖含量較高，為27.15 mg/g；隨后隨著時間延長多糖含量開始下降，這可能是多糖在水中浸提時間過長后結構遭到破壞導致的[23]。

圖3 浸提時間對金蟬花多糖含量的影響Fig. 3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

2.1.4 浸提溫度對金蟬花多糖含量的影響

在超聲時間20 min、超聲功率120 W、浸提時間120 min、液料比50∶1（mL/g）的條件下，考察浸提溫度對金蟬花多糖含量的影響。從圖4可看出，當浸提溫度小于80 ℃，隨著浸提溫度升高，金蟬花多糖含量不斷的增加；但當浸提溫度大于80 ℃時，隨著浸提溫度的升高金蟬花多糖含量反而明顯下降，這一現象可能是由于溫度不斷升高，從而使得多糖部分水解[24]。因此，金蟬花多糖提取溫度可控制在80 ℃左右。

圖4 浸提溫度對金蟬花多糖含量的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

2.1.5 液料比對金蟬花多糖含量的影響

當超聲時間20 min、超聲功率120 W、浸提溫度80 ℃、浸提時間120 min條件下，考察液料比對金蟬花多糖提取的影響。由圖5可知，液料比對金蟬花多糖浸提有一定的影響，金蟬花多糖含量隨著液料比的增大呈現出先增加后降低的趨勢。當液料比達到50∶1（mL/g）時，金蟬花多糖含量較高，達27.32 mg/g。

圖5 液料比對金蟬花多糖含量的影響Fig. 5 Effect of solvent-to-solid ratio on polysaccharide yield

2.2 金蟬花多糖提取工藝條件的優化

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗

在單因素試驗基礎上，選用響應面分析法對金蟬花多糖的提取工藝條件進行優化。試驗方案設計及結果見表2。

表2 響應面優化試驗設計與結果Table2 Experimental design with experimental values of polysaccharide yield for response surface analysis

利用Design-Expert 8.0軟件，建立浸提時間、浸提溫度及液料比三因子數學回歸模型為：Y=27.54-1.06A-0.072B-0.36C-0.24AB-0.19AC-0.035BC-1.12A2-0.45B2-1.0C2。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

從表3可看出，一次項中，A（浸提時間）對多糖含量的線性效應極顯著（P＜0.001），C（液料比）對多糖含量的線性效應顯著（P＜0.05），B（浸提溫度）對多糖含量的線性效應不顯著（P＞0.05），二次項中，A2、C2影響均極顯著（P＜0.001），B2影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BC影響不顯著（P＞0.05）。此模型顯著性檢測P值為0.000 4，極顯著，失擬項P值為0.055 3，不顯著，校正模型的相關系數R2值為0.962 0，決定系數值為0.913 1，說明選用的模型與實際情況擬合較好、誤差小，能較好反應出各因素與金蟬花多糖含量之間關系。由F值可知，在試驗范圍內各因素對多糖含量的影響大小依次為A（浸提時間）＞C（液料比）＞B（浸提溫度）。

2.2.2 交互作用影響結果

圖6 各因素交互作用對多糖含量影響的響應面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield

由圖6可知，浸提時間、浸提溫度和液料比對金蟬花多糖的提取都有著顯著的影響。其中，浸提時間影響最為顯著，圖中曲面陡峭，隨著浸提時間延長金蟬花多糖含量增加；液料比的影響相對顯著，曲面較為陡峭；浸提溫度影響次之，表現為曲面平緩。

通過回歸模型的分析，以多糖含量為評價指標，金蟬花多糖適宜的提取工藝參數為浸提時間136.33 min、浸提溫度77.80 ℃、液料比47.84∶1（mL/g）。在此條件下，模型預測金蟬花多糖含量為26.71 mg/g。考慮到實際應用過程中操作簡便，將工藝條件修正為浸提時間130 min、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1（mL/g）；在此條件下，得到金蟬花多糖含量為26.14 mg/g，誤差為0.57 mg/g，實際值與理論值基本相符，說明模型對金蟬花多糖提取工藝條件參數優化可靠可行，具有一定的實用價值。

2.3 金蟬花多糖抗氧化活性的測定結果

2.3.1 總還原能力

圖7 不同質量濃度多糖的總還原能力Fig. 7 Total reducing capacity of WSP as a function of its concentration

如圖7所示，在質量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內，金蟬花多糖和VC還原能力均隨著質量濃度增加而增強，兩者還原能力相近，而茯苓多糖還原力明顯低于金蟬花多糖和VC。表明金蟬花多糖具有良好的還原能力，此結果與封燕等[25]的研究結果相一致。

2.3.2 清除DPPH自由基的能力

圖8 多糖對DPPH自由基清除能力Fig. 8 Scavenging effect of WSP on DPPH

由圖8可知，金蟬花多糖清除DPPH自由基能力較強。在質量濃度10～100 μg/mL范圍內，金蟬花多糖和VC隨著溶液質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力先增強后趨于穩定，其中當質量濃度大于60 μg/mL，金蟬花多糖對DPPH自由基的清除率趨于平緩，基本保持在82%以上，而此質量濃度范圍內，茯苓多糖對DPPH自由基的清除率基本在10%以下，明顯低于金蟬花多糖。經線性擬合，金蟬花多糖對DPPH自由基的IC50值為28.99 μg/mL。

2.3.3 對·OH的清除作用

圖9 多糖對·OH的清除能力Fig. 9 Scavenging effect of WPS on ·OH

由圖9可知，在質量濃度0.1～0.6 mg/mL范圍內，金蟬花多糖隨著質量濃度的增加，對·OH的清除能力逐漸增強；金蟬花多糖溶液質量濃度從0.1 mg/mL增加到0.6 mg/mL，對·OH的清除率從29.02%增加到87.56%；此時，VC的清除率基本保持在96%以上，較金蟬花多糖清除能力強，但茯苓多糖的清除率基本保持在10%以下，明顯低于金蟬花多糖。根據清除率擬合曲線y=1.228 7x＋0.223 2，R2=0.922 9，經線性擬合，金蟬花多糖對·OH的IC50值為0.19 mg/mL。

由圖10可知，在質量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內，蟬花多糖對·清除能力隨著溶液質量濃度的增加而增強，金蟬花多糖質量濃度從0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，清除率從18.78%增加到67.40%。經線性擬合，金蟬花多糖對·的IC50值為0.30 mg/mL。

圖10 多糖對·的清除能力Fig. 10 Scavenging effect of WSP on

3 結 論

采用超聲波輔助水提醇沉法提取了金蟬花多糖，并利用響應面分析法進行優化，得到金蟬花多糖提取工藝參數為浸提時間130 min、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1（mL/g），在此條件下金蟬花多糖含量實際值為26.14 mg/g。

通過測定金蟬花多糖總還原力、清除DPPH自由基、·OH、·能力等多項指標評價金蟬花多糖抗氧化活性，結果顯示金蟬花多糖對DPPH自由基、·OH、·的IC50分別為28.99 μg/mL、0.19 mg/mL、0.30 mg/mL，表明金蟬花多糖具有較強的抗氧化能力。研究結果與魯吉珂[26]、Zhu Zhenyuan[27]等相一致。此外，金蟬花多糖對DPPH等自由基的清除能力與文獻[28-29]對冬蟲夏草多糖抗氧化活性的研究結果相似，這也說明金蟬花多糖具有較好的抗氧化活性。

[1] 溫魯, 唐玉玲, 張平. 蟬花與有關蟲草活性成分檢測比較[J]. 江蘇中醫藥, 2006, 27(1): 45-46.

[2] 葛飛, 夏成潤, 李春如, 等. 蟬擬青霉菌絲體與天然蟬花中化學成分的比較分析[J]. 菌物學報, 2007, 26(1): 68-75. DOI:10.13346/j.mycosystema.2007.01.012.

[3] 于士軍, 柴新義, 樊美珍. 蟬花菌質主要營養成分和活性成分分析[J]. 食品與機械, 2015, 31(1): 155-158. DOI:10.13346/j.mycosystema.2007.01.012.

[4] 蔣玉蓉, 袁俊杰, 孫雪婷, 等. 藜麥葉片多糖最佳提取工藝及抗氧化性研究[J]. 中國食品學報, 2017, 17(2): 110-117. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.02.015.

[5] 謝飛, 李偉, 陳美珍, 等. 野生蟬花多糖抗腫瘤活性及其作用機制[J].食品科學, 2016, 37(13): 209-213. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613038.

[6] 宋捷民, 忻家礎, 朱英. 蟬花對小鼠血糖及造血功能影響[J].中華中醫藥學刊, 2007, 25(6): 1144-1145. DOI:10.13193/j.archtcm.2007.06.57.songjm.022.

[7] SHU C, WEN G, CHENG J, et al. Immunomodulatory functions of extracts from the Chinese medicinal fungus Cordyceps cicadae[J].Journal of Ethnopharmacology, 2002, 83: 79-85. DOI:10.1016/S0378-8741(02)00212-X.

[8] HYUNG S K, YEON J K, HONG K L, et al. Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll-like receptor 4[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012,50: 3190-3197. DOI:10.1016/j.fct.2012.05.051.

[9] LUO X P, DUAN Y Q, YANG W Y, et al. Structural elucidation and immunostimulatory activity of polysaccharide isolated by subcritical water extraction from Cordyceps militaris[J]. Carbohydrate Polymers,2017, 157: 794-802. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.10.066.

[10] 朱碧純, 柴一秋, 章思思, 等. 蟬花蟲草活性成分的抗驚厥作用[J]. 菌物學報, 2016, 35(5): 619-627. DOI:10.13346/j.mycosystema.150197.

[11] 楊娜, 王鴻飛, 郝艷佳, 等. 裂褶菌多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國食品學報, 2014, 14(8): 92-98. DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.08.007.

[12] QU C, YU S, JIN H, et al. The pretreatment effects on the antioxidant acitivity of jujube polysaccharides[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013, 114: 339-343.DOI:10.1016/j.saa.2013.05.084.

[13] 張惟杰. 復合多糖生化研究技術[M]. 上海: 上海科學技術出版社,1987: 7.

[14] 丁宏偉. 超聲波結合微波輔助提取米糠多糖的研究[J]. 核農學報,2013, 27(3): 329-333.

[15] DOU J, MENG Y, LIU L, et al. Purification,characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thinned-young apple[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 72: 31-40.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2014.07.053.

[16] PAN Y M, WANG K, HUANG S, et al. Antioxidant activity of microware-assisted extract of longan (Dimocarpus longan Lour.)peel[J]. Food Chemistry, 2008, 106(3): 1264-1270.

[17] 陳晉明, 馮翠萍. 白靈菇多糖抗氧化活性研究[J]. 食品科技, 2015,40(2): 239-242. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.02.049.

[18] 賈之慎, 鄔建敏. 比色法測定Fenton法產生的羥基自由基[J]. 生物化學與生物物理進展, 1996, 23(2): 184-186.

[19] 朱燕, 程東慶. 蟬花多糖抗氧化活性的測定[J]. 中華中醫藥學刊, 2009,27(7): 1552-1554. DOI:10.13193/j.archtcm.2009.07.209.zhuy.066.

[20] 朱月, 馬金蓮. 真菌多糖對氧自由基的清除作用[J]. 赤峰學院學報,2013, 29(9): 9-12. DOI:10.13398/j.cnki.issn1673-260x.2013.18.004.

[21] 馬赟, 索菲婭, 盧帥, 等. 不同產地新疆蟲草體外抗氧化作用[J]. 中國醫院藥學雜志, 2014, 14(34): 1145-1148. DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.14.01.

[22] 楊娜, 王鴻飛, 宋佳敏, 等. 超聲波輔助提取裂褶菌多糖及分離純化的研究[J]. 核農學報, 2014, 28(11): 2015-2024.

[23] 楊文雅, 李長征, 張海暉, 等. 蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業科技, 2016(5): 252-253. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.041.

[24] 王吉標, 歐陽臻, 趙明, 等. 響應面分析法優化金蟬花多糖的提取工藝[J]. 天然產物研究與開發, 2014, 26(3): 438-443. DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.03.031.

[25] 封燕, 貢小輝, 韋德群, 等. 金蟬花多糖的抗氧化活性及結構分析[J].食品科學, 2016, 37(12): 19-24. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613004.

[26] 魯吉珂, 古國峰, 汪瑞, 等. 蟬花多糖提取工藝優化研究[J].食品工業科技, 2013, 34(22): 196-199. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.22.040.

[27] ZHU Z Y, LIU F, GAO H, et al. Synthesis, characterization and antioxidant activity of selenium polysaccharide from Cordyceps militaris[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016,93: 1090-1099. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.09.076.

[28] DONG C H, YAO Y J. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis[J]. Science Direct, 2008, 41(4): 669-677. DOI:10.1016/j.lwt.2007.05.002.

[29] WANG J J, KAN L J, NIE S P, et al. A comparison of chemical composition, bioactive components and antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 63(1): 2-7. DOI:10.1016/j.lwt.2015.03.109.