坦洋工夫紅茶多糖提取工藝優化及其抑制腫瘤活性分析

孫蘇軍，紀海玉，白 云，于 娟，馮瑩瑩，董曉丹，劉安軍*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

坦洋工夫紅茶是以來自福建福安茶樹的芽葉為原料，經過萎凋、揉捻、發酵、干燥等典型工藝過程精制而成的全發酵茶類[1]，富含兒茶素、茶黃素和茶紅素等多種抗氧化多酚物質及具有生物活性的碳水化合物等[2]。研究發現，氧化損傷可導致人體一些慢性疾病的發生，如癌癥、心血管疾病和炎癥等[3]。而紅茶多酚體內外實驗均表現出較強的抗氧化能力[4-5]，可降低多種疾病的發病率，增強機體的抗腫瘤能力[6]。紅茶多糖是來源于紅茶中的一種重要的功能性碳水化合物，因其良好的水溶性而更容易被機體消化吸收[7]，但目前關于紅茶多糖提取工藝及生物活性的研究較少。

癌癥治愈困難，致死率高，嚴重影響著人類的健康[8]。近年來，一些多酚類物質[9]和海藻硫酸多糖[10]表現出了優秀的抗腫瘤活性且無明顯的副作用，而關于紅茶多糖的抗腫瘤活性則需進一步探索。傳統的茶多糖提取方法為水溶醇沉法[11-12]，提取過程中的液料比、提取溫度、提取時間及浸提次數均會影響多糖得率。研究發現，不同產地和品種的茶葉中茶多糖的結構和活性也不相同，河東綠茶多糖具有免疫調節、抗腫瘤活性[13]，黃山綠茶多糖具有降血糖作用[14]，紫陽綠茶多糖具有抗疲勞活性[15]，普洱茶多糖具有抗氧化功能以及抑制α-糖苷酶作用[16]等。

鑒于目前對紅茶的研究主要集中在其多酚化合物的抗腫瘤和抗氧化活性上，而對紅茶多糖的提取工藝以及其抗腫瘤活性研究鮮有報道。因此，利用響應面法對紅茶多糖的水溶醇沉提取工藝進行優化，并初步研究其在BALB/c小鼠體內抗腫瘤活性，為紅茶多糖的進一步開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶：坦洋工夫紅茶，產地福建福安。

實驗動物：BALB/c小鼠40 只，雌性，體質量19～21 g，購于北京大學醫學部（SCXK（京）2011-0012）。

試劑：無水乙醇購自天津市江天化工技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SY-2000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司；真空冷凍干燥機、ST16R冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶多糖的提取工藝

工藝流程：紅茶→清洗→熱水提取→抽濾→上清液→減壓濃縮→75%乙醇醇沉→離心→沉淀→無水乙醇洗滌→加水溶解→離心→水溶液→冷凍干燥→粗多糖。

操作要點：將紅茶熱水提取液抽濾后，收集上清液在旋轉蒸發器上55 ℃濃縮至約40 mL，加入3 倍體積的無水乙醇進行醇沉，放置過夜后，混合物3 500 r/min離心15 min，收集沉淀。將沉淀用無水乙醇洗滌2 次，加去離子水溶解后棄去沉淀，將水溶液3 500 r/min離心15 min，收集上清液并將其冷凍干燥，得到紅茶多糖。

1.3.2 多糖得率的計算

按照公式（1）計算多糖得率：

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 液料比對多糖得率的影響

在提取溫度60 ℃條件下，分別以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提3 次。試驗重復3 次，考察液料比對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對多糖得率的影響

以液料比20∶1（mL/g），分別在30、40、50、60、70 ℃溫度條件下提取60 min，浸提3 次。試驗重復3 次，考察提取溫度對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.3 提取時間對多糖得率的影響

以液料比20∶1（mL/g）、60 ℃條件下分別提取40、50、60、70、80 min，浸提3 次。試驗重復3 次，考察提取時間對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.4 浸提次數對多糖得率的影響

在提取溫度60 ℃條件下，以20∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提次數分別為1、2、3、4、5 次。試驗重復3 次，考察浸提次數對紅茶多糖得率的影響。

1.3.4 響應面試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選定液料比、提取時間與提取溫度為自變量，多糖得率為響應值，根據Box-Behnken設計原理，采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計，優化紅茶多糖的提取工藝，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗的因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.5 紅茶多糖純化方法及結構分析

粗多糖水溶液通過反復凍融8 次，2 300×g離心20 min棄去沉淀，除掉蛋白、不穩定多糖等大分子物質，而后通過3 500 Da透析袋透析，除掉小分子雜質，冷凍干燥得到冷溶性多糖組分，經苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法分析多糖的總糖及蛋白含量，通過氣相色譜和紅外光譜分析多糖的單糖組成及結構特性。

1.3.6 紅茶多糖體內抗腫瘤活性測定

將40 只BALB/c小鼠隨機分為4 組，分別為空白對照組（灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水）、模型對照組（灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水）、紅茶多糖低劑量組（500 mg/（kg·d））、紅茶多糖高劑量組（1 000 mg/（kg·d）），每組10 只，灌胃15 d后，在除空白對照組以外的各組小鼠右腋下接種H22腫瘤細胞（2×106個/只），并繼續灌胃21 d，每3 d記錄一次小鼠質量，接腫瘤1 周后每天用游標卡尺測量腫瘤長度（L/cm）和寬度（W/cm），計算荷瘤小鼠實體腫瘤體積（V/cm3）并繪制其變化曲線圖。按照公式（2）計算腫瘤體積：

實驗期結束，對小鼠末次灌胃后，斷糧12 h，斷頸處死，解剖取小鼠脾臟、胸腺及腫瘤并稱質量，按照公式（3）～（5）計算脾臟指數、胸腺指數及抑瘤率[17-18]：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對紅茶多糖得率的影響

圖1 液料比對紅茶多糖得率的影響Fig. 1 Effects of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由圖1可知，在溶劑用量較小時，原料中的多糖不能夠全部轉移到溶劑中，造成提取不完全、多糖得率較低。增大溶劑用量可以使內部的植物細胞和外部溶劑之間產生更大的濃度差，有利于多糖更迅速地擴散溶出[19]。但溶劑用量過大時，多糖得率并沒有繼續升高，甚至有降低趨勢，這可能是由于溶液濃度過低，致使后續的濃縮和沉淀工藝難度加大，操作步驟增多，造成部分多糖的損失，導致多糖得率下降?？紤]到節約能源，選擇30∶1（mL/g）左右的液料比比較合適。

2.1.2 提取溫度對紅茶多糖得率的影響

如圖2所示，隨提取溫度的升高，紅茶多糖的得率呈先上升后下降的趨勢，其中在30～60 ℃之間提取率顯著提高，60 ℃時達到最大值。隨著提取溫度的升高，多糖的擴散系數增大，使水溶液中多糖的含量增加。然而，溫度過高可造成多糖的降解[20]，導致多糖得率降低，同時增加了能源消耗。因此，提取溫度選在60 ℃左右。

圖2 提取溫度對紅茶多糖得率的影響Fig. 2 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharide

2.1.3 提取時間對紅茶多糖得率的影響

圖3 提取時間對紅茶多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide

從圖3可以看出，在40～70 min的提取時間范圍內，多糖得率明顯上升，在70 min時達到最大，之后提取時間的延長反而導致多糖得率下降。這是因為提取時間的延長可使多糖溶出到溶劑中變得更簡單迅速[20]，但提取時間過長也會導致多糖的降解，使其得率降低[21]。因此，提取時間應控制在70 min左右。

2.1.4 浸提次數對紅茶多糖得率的影響

圖4 浸提次數對紅茶多糖得率的影響Fig. 4 Effect of number of extractions on the extraction yield of polysaccharide

由圖4可以看出，浸提3 次時，多糖得率達到最高，且繼續增加浸提次數時，多糖得率也不再有明顯的變化。說明浸提次數越多，能源消耗越大，且濃縮時的多糖損耗也會增加[22]。因此選擇浸提3 次。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

通過單因素試驗發現，當液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時間70 min、浸提3 次時，能夠得到紅茶多糖最大得率。如表2所示，將液料比、提取溫度和提取時間作為研究因素，以紅茶多糖得率為響應值，共得到17 個試驗點，其中12 個為析因點，1 個為中心點，中心點試驗進行5 次，用來估計誤差。運用Design-Expert 8.0軟件進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=10.14-1.55A＋0.71B-0.28C＋0.014AB＋0.65AC-0.33BC-1.79A2-1.98B2-1.56C2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table2 Box-Behnken design with experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

對紅茶多糖提取的回歸數學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數，由表3可知，該試驗選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項不顯著（P=0.131 4＞0.05），說明非試驗因素對試驗結果的影響不大。另外，所選模型的決定系數R2值為0.974 5，這表明該模型與實際試驗擬合較好，校正后的決定系數值為0.941 8，與R2值接近，說明了模型有充分的準確性和通用性。從表3還可以看出，A、B、A2、B2、C2對多糖得率影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對多糖得率影響顯著（P＜0.05）；其他因素的影響不顯著。

2.2.2 交互作用結果分析

圖5 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of polysaccharide

如圖5所示，通過對以上3 個交互作用的分析可以預測和檢驗變量的響應值以及確定變量之間的相互關系[23]，響應面曲線越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。同樣，等高線的形狀也可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[24]。通過響應面的陡峭程度分析發現，液料比對紅茶多糖得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時間，且只有液料比和提取時間交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

2.3 驗證實驗結果

通過Design-Expert 8.0軟件分析，得到紅茶多糖提取的最佳條件為液料比27.64∶1（mL/g）、提取時間69.73 min、提取溫度61.1 ℃，紅茶多糖的提取率達到10.56%。考慮到實際情況對上述條件進行修正，最終的優化條件為液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時間70 min，在此條件下進行3 次平行實驗驗證，得到多糖得率為（10.52±0.21）%，與理論預測值較接近，說明用該模型對紅茶多糖的提取進行工藝優化具有一定的實際可操作性。

2.4 紅茶多糖成分及結構分析

2.4.1 紅茶多糖主要成分及單糖組成

表4 紅茶多糖主要成分及單糖組成Table4 Major components and monosaccharide composition of black tea polysaccharide

如表4所示，經凍融透析純化后紅茶多糖的總糖質量分數達76%，而蛋白質卻僅含2%。單糖組成分析發現在紅茶多糖中阿拉伯糖和半乳糖醛酸含量最高，質量分數分別達34%和30%；其次為葡萄糖和半乳糖，所占比例為14%和13%；巖藻糖和鼠李糖含量最低。

2.4.2 紅茶多糖紅外光譜分析

圖6 紅茶多糖紅外光譜分析Fig. 6 FT-IR spectra of black tea polysaccharide within the range of 4 000–400 cm－1

由圖6可以看出，紅茶多糖在3 423.67、2 931.34、1 733.81、1 643.81、1 407.57、1 248.04、1 076.45、601.44 cm-1均表現出較強的吸收峰。紅茶多糖在3 423.67 cm-1處的譜峰表示O—H基團的伸縮振動，2 931.34 cm-1歸屬于C—H伸縮振動和彎曲振動[25]，1 733.81 cm-1和1 407.57 cm-1處的吸收峰則表示有羧基和羰基的存在[26]，表示含有糖醛酸，而在500～900 cm-1處的吸收峰則表示該多糖含有吡喃環[27]。結果表明該多糖為含有吡喃環和糖醛酸，與上述數據一致。

2.5 紅茶多糖體內抗腫瘤活性檢測結果

2.5.1 各組小鼠體質量變化

圖7 各組小鼠體質量變化Fig. 7 Changes in body weight of mice in all groups

各組小鼠適應環境1 周后，開始灌胃給藥，灌胃14 d后接種H22腫瘤細胞。由圖7可知，各組小鼠體質量在接種腫瘤細胞前無明顯差異，均無明顯的消瘦現象及由于藥物引起的病變及中毒現象[28]，體質量穩定，說明紅茶提取物對小鼠無不良影響，而后期由于實體腫瘤的生長導致荷瘤小鼠體質量偏大。

2.5.2 荷瘤小鼠實體腫瘤體積變化

圖8 荷瘤小鼠實體腫瘤體積變化Fig. 8 Changes in tumor volume in H22 tumor-bearing mice

如圖8可知，在接種H22腫瘤細胞第8天開始，模型組小鼠的腫瘤體積大幅度增大，多糖灌胃組小鼠腫瘤體積雖然也呈上升趨勢，但是增幅緩慢，部分多糖組小鼠的腫瘤甚至出現先增長后萎縮的趨勢。結果表明，紅茶多糖對體內實體腫瘤的生長有明顯的抑制作用。

2.5.3 臟器指數及抑瘤率

表5 紅茶多糖對荷瘤小鼠免疫器官及腫瘤的作用Table5 Effects of black tea polysaccharide on immune organ indexes and tumor growth inhibition in tumor-bearing mice

脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官，脾臟和胸腺指數是反映動物機體免疫功能最基本也是最常規的指標，已被廣泛應用于評價機體的整體免疫狀態[29-30]。實驗期結束后，對荷瘤小鼠進行解剖，稱取各組小鼠的脾臟、胸腺和實體腫瘤，計算得出相應的脾臟指數、胸腺指數和抑瘤率，如表5所示。與空白組相比，模型組荷瘤小鼠的脾臟明顯腫大（P＜0.01），胸腺嚴重萎縮（P＜0.05），而灌胃多糖組小鼠的臟器指數較模型組均有明顯的改善，更接近正常組。結果表明，腫瘤細胞的惡性增殖嚴重損害了模型組小鼠的免疫系統；而紅茶多糖可顯著抑制體內腫瘤細胞的增殖，有效地保護了小鼠的脾臟和胸腺，且呈劑量相關性，高劑量組（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可達66.30%。

3 結 論

以紅茶多糖得率為考察指標，通過單因素試驗和響應面分析法獲得紅茶多糖最優提取條件為液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時間70 min，紅茶多糖得率達10.52%，經純化后多糖質量分數達76%，主要由阿拉伯糖（34%）、半乳糖醛酸（30%）、葡萄糖（14%）、半乳糖（13%）、巖藻糖（5%）和鼠李糖（4%）組成，紅外光譜分析也表明其含有糖醛酸和吡喃環結構?？鼓[瘤動物實驗研究結果表明，紅茶多糖可顯著保護荷瘤小鼠脾臟和胸腺，并抑制其體內實體腫瘤的生長，且呈劑量相關性，高劑量組（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可達66.30%。

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