大孔樹脂固定化磷脂酶A1及其用于菜籽油脫膠工藝的優化

水龍龍，操麗麗，龐 敏，潘麗軍，鮑 賽，李進紅，姜紹通*

（合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

菜籽經過壓榨得到菜籽毛油，毛油中雜質較多，易氧化變質，甚至含有農藥殘留、重金屬等有害物質，故需要對毛油進行精煉。精煉工藝主要為脫膠、脫酸、脫色和脫臭。脫膠是油脂精煉過程中的關鍵步驟之一，脫膠效果的優劣，對后續的精煉工藝以及成品油的品質有重大影響[1]。脫膠是脫除膠質物質的過程，磷脂是膠質物質的主要成分，有水化磷脂和非水化磷脂之分。酸法脫膠和水化脫膠是油脂工廠常用的脫膠方法。水化脫膠工藝只能去除油脂中的水化磷脂，無法脫除非水化磷脂。酸法脫膠只可以脫除水化磷脂和少量的非水化磷脂，仍會殘留大部分的非水化磷脂，并且會消耗較多的堿，產生較多的廢水[2]。

酶法脫膠利用磷脂酶將非水化磷脂水解為溶血磷脂，可以將非水化磷脂從油脂中除去[3]。與酸法脫膠和水化脫膠相比，酶法脫膠具有反應條件溫和、化學試劑用量少、環境污染小等優勢[4]。然而，游離酶用于油脂脫膠存在著易失活、無法重復使用、價格高等劣勢[5]。通過將磷脂酶固定在載體上，制得固定化酶可以在很大程度上彌補這種劣勢。固定化酶依然保留著游離酶對底物的特異性和高效性，還可以提高酶的穩定性，實現酶的重復使用，有效降低了酶的使用成本[6]。

常見酶的固定化方法有物理吸附法、交聯法、共價偶聯法和包埋法[7]。將磷脂酶固定在大孔樹脂上的操作過程簡單，對酶分子結構影響小，作為載體的樹脂還可以回收重復使用，但同時也存在著酶較易脫落的缺點[8]。大孔樹脂固定化脂肪酶和磷脂酶已有較多研究[7-13]，但將大孔樹脂固定化磷脂酶用于菜籽油脫膠的研究鮮見報道。本實驗以廉價易得的大孔樹脂為磷脂酶固定化材料，優化大孔樹脂固定化磷脂酶的最佳條件，并將固定化酶用于菜籽油脫膠實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷脂酶A1（Lecitase? Ultra，酶活力5 000 U/mL） 丹麥諾維信公司；大孔樹脂（型號D001、D113、D1400、D201、D301、D314、DA201和SA-2） 安徽三星樹脂科技有限公司；大豆卵磷脂 上海藍季科技發展有限公司；菜籽毛油（實測初始磷含量為72.6 mg/kg） 安徽合肥市售；乙醇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸聯胺、鉬酸鈉、氧化鋅、濃鹽酸、濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

NSKY-110WX型水浴搖床 上海蘇坤實業有限公司；FA25型高剪切分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；T6新世紀型雙光束紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ZDJ-4B型自動電位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；DZF-6053型真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司：SX2-4-10型箱式電阻爐 黃石市恒豐醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酶的制備

取100 g樹脂于500 mL燒杯中，加入300 mL無水乙醇浸泡24 h后抽濾，用去離子水將乙醇洗凈，依次將樹脂用5% HCl和5% NaOH溶液浸泡3 h后抽濾，然后用去離子水沖洗直至中性。取一定量大孔樹脂、緩沖液（0.02 mol/L磷酸氫二鈉溶液與0.01 mol/L檸檬酸溶液按不同比例混調）和磷脂酶A1于錐形瓶中，水浴搖床室溫振蕩吸附一定時間，過濾分離載體和上清液，并用緩沖液清洗載體，將固定化酶于30 ℃真空干燥后保存于4 ℃冰箱中[7-9]。

1.3.2 載體樹脂的蛋白吸附量測定

蛋白含量測定采用Bradford法[14]，載體的蛋白吸附率按公式（1）計算：

式中：X1為固定化前酶液的蛋白質量/mg；X2為固定化后上清液的蛋白質量/mg。

1.3.3 固定化磷脂酶A1活力的測定

參照占劍鋒等[15]方法，稍作更改：將4%的無油大豆卵磷脂和0.5%的聚乙烯醇溶于一定pH值的緩沖液中，用高剪切分散乳化機將混合液10 000 r/min均質10 min，獲得底物溶液。取30 mL底物溶液于100 mL錐形瓶中，50 ℃水浴搖床預熱10 min后加入預定量的固定化酶，同時作空白對照。180 r/min反應10 min后，立即加入15 mL 95%乙醇溶液終止酶解反應，使用自動電位滴定儀，以0.1 mol/L NaOH溶液為滴定劑滴定底物溶液，計算NaOH溶液的平均消耗量。

定義在特定的條件下1 min水解磷脂產生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為1 個磷脂酶活力單位（U）。固定化磷脂酶A1活力為每克固定化酶含有的磷脂酶活力單位（U/g）。固定化磷脂酶A1活力按公式（2）計算：

式中：X為樣品酶活力/（U/g）；V為滴定實驗組時消耗NaOH溶液的體積/mL；V0為滴定空白組時消耗NaOH溶液的體積/mL；c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；m為加入固定化酶的質量/g；t為酶解反應時間/min。

1.3.4 pH值和反應溫度對固定化酶與游離酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別在不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、不同反應溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）條件下，按1.3.3節方法測定酶活力，定義不同pH值和反應溫度條件下所測得的酶活力中最高者為100%。

1.3.5 酶法脫膠實驗

參照文獻[16]，稍作改動：取200 g菜籽毛油于錐形瓶中，水浴加熱至80 ℃，加入45%的檸檬酸0.24 mL，10 000 r/min均質1 min，置于80 ℃水浴鍋中500 r/min攪拌20 min。再加入一定量的4% NaOH溶液調節到預定pH值。再加入4 mL蒸餾水和一定量的固定化酶，在50 ℃、180 r/min條件下，水浴搖床酶解反應一段時間。將所得的脫膠油5 000 r/min離心20 min，取上層油樣測定磷含量。磷含量的檢測方法參照GB/T 5537—2008《糧油檢驗 磷脂含量的測定》。

1.3.6 酶法脫膠工藝條件優化

1.3.6.1 單因素試驗

按1.3.5節方法，進行脫膠試驗，分別考察固定化酶添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/kg）、反應pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、反應溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、反應時間（1、2、3、4、5 h）對脫膠效果的影響，每組試驗重復3 次。

1.3.6.2 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，進行響應面試驗設計，確定最佳的脫膠條件，每組試驗重復3 次。響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Variables and their levels used for response surface design

1.3.7 固定化酶重復使用性實驗

將固定化酶在響應面法獲得的最佳條件下進行菜籽毛油脫膠實驗。固定化酶重復使用5 次，每次脫膠實驗后，回收固定化酶，并用pH 5.0的緩沖液沖洗干凈，并測定酶活力及脫膠油中的磷含量，規定固定化酶原來的酶活力為100%。

2 結果與分析

2.1 固定化載體的選擇

選取8 種不同的大孔樹脂作為磷脂酶A1的固定化載體。固定化條件為緩沖液pH 5.0，酶添加量2 mL/g（磷脂酶A1的蛋白質量濃度為16.65 mg/mL），室溫振蕩吸附6 h，收集上清液并將所得的固定化酶真空干燥，測定各種樹脂的蛋白吸附率和固定化酶活力，結果如表2所示。

表2 不同樹脂的物化性質及固定化效果Table2 Physical properties and enzyme immobilization capacity of resins

大孔樹脂主要借助氫鍵、范德華力或者是某些功能基團將酶固定在其周圍，樹脂的理化性質對固定化效率和固定化酶活力有至關重要的影響[9,11]。離子交換樹脂表面的帶電基團與酶分子表面特殊官能團可以形成離子鍵，通過范德華力和離子鍵的作用，離子交換樹脂可以將酶吸附在其表面，大孔吸附樹脂則通過范德華力和氫鍵將酶吸附在其周圍。從表2可以看出，蛋白吸附率越大，固定化酶活力越高，在選擇的8 種大孔樹脂中，陽離子交換樹脂D001的固定化效果最好，酶活力最高。因此選擇D001樹脂作為固定化磷脂酶A1的最適載體。

2.2 固定化反應條件優化

2.2.1 最適固定化pH值的確定

取2 g D001型大孔樹脂，加入3 mL磷脂酶，20 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液，置于水浴搖床中，室溫振蕩4 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結果如圖1所示。

圖1 pH值對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 1 Effect of pH on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

由圖1可知，固定化酶活力和蛋白吸附率均隨pH值的增加而先增大后減小，在pH 5.0時，酶活力和蛋白吸附率同時達到最大值。pH值的改變會影響酶活性中心上必需基團的解離程度以及底物的解離狀態。只有在最合適的

pH值條件下，酶和底物才會達到最佳的結合狀態，從而表現最大的酶活力[19]。固定化酶活力與游離酶活力相比要低很多，可能是因為固定化酶被大量吸附在載體的表面，在反應時無法與底物進行充分的接觸，從而表現出較低的酶活力。

2.2.2 最適酶添加量的確定

圖2 酶添加量對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 2 Effect of phospholipase amount on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

取2 g D001型大孔樹脂，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的磷脂酶，pH 5.0的緩沖液20 mL，置于水浴搖床中，室溫振蕩4 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結果如圖2所示。

由圖2可知，當酶添加量少于1.5 mL/g時，固定化酶活力隨酶添加量的增加而逐漸增加，當酶添加量超過1.5 mL/g后，酶活力不再增加，而是趨于穩定。蛋白吸附率則隨著酶添加量的增大而逐漸減小?？赡艿脑蚴钱斆柑砑恿枯^少時，樹脂可以盡可能多地吸附溶液中的酶蛋白，故固定化效率較高，但是酶活力較低；隨著酶添加量繼續增加，樹脂逐漸達到飽和狀態，無法吸附更多的酶蛋白，酶活力也不再增加，固定化效率也逐漸減小[7]。

2.2.3 最適固定化時間的確定

取2 g D001型大孔樹脂，加入3.0 mL磷脂酶，pH 5.0緩沖液20 mL，置于水浴搖床中，室溫振蕩吸附1、2、4、6、8 h后過濾，收集上清液和固定化酶，將固定化酶于30 ℃真空干燥箱中干燥，測定各條件下固定化酶活力，結果如圖3所示。

圖3 固定化時間對固定化酶活力和蛋白吸附率的影響Fig. 3 Effects of reaction time on the activity of immobilized phospholipase and immobilization efficiency

由圖3可知，固定化酶活力和蛋白吸附率隨固定化時間的變化趨勢為逐漸增加，在4 h以后幾乎保持不變。因為樹脂的吸附量是固定的，故隨著時間的延長，樹脂逐漸達到飽和吸附狀態，無法繼續吸附更多的酶蛋白，酶活力和蛋白吸附率也不再發生變化。

綜上所述，大孔樹脂D001固定化磷脂酶A1的最佳條件為pH 5.0、酶添加量1.5 mL/g、固定化時間4 h。在此條件下固定化磷脂酶A1活力為665.8 U/g，蛋白吸附率為62.3%。

2.3 溫度和pH值對固定化酶和游離酶活力的影響

由圖4A可知，固定化酶和游離酶的最適溫度基本保持一致，均在50 ℃左右。當溫度在40～65 ℃之間時，固定化酶的相對酶活力均比游離酶高，這說明固定化酶比較穩定，酶活力變化較小。由圖4B可知，固定化酶和游離酶最適pH值均在5.0附近。當pH值超過6.0之后，相對酶活力均呈直線下降趨勢，但固定化酶能在更廣的pH值范圍內保持較高的相對酶活力。許多研究表明[20-23]，將酶固定在適合的載體上，可以降低酶對溫度和pH值的敏感性。由于載體將酶固定在其周圍，減小了pH值和溫度對酶活性中心的影響，因此固定化酶在較廣的溫度和pH值范圍內均能保持較高酶活力[24-25]。

圖4 固定化酶的最適溫度（A）和最適pH值（B）分析Fig. 4 Optimum temperature (A) and pH (B) for immobilized and free phospholipase

2.4 固定化酶脫膠工藝優化結果

2.4.1 單因素試驗結果

圖5 固定化酶添加量（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）和反應pH值（D）對脫膠效果的影響Fig. 5 Effects of phospholipase dosage (A), reaction time (B), temperature (C)and pH value (D) on degumming efficiency

由圖5A可知，當固定化酶添加量逐漸增大時，脫膠油中磷含量逐漸降低，當酶添加量超過1.5 g/kg后，磷含量基本不再發生變化，考慮到酶的成本，選擇酶添加量為1.5 g/kg。由圖5B可知，隨著反應時間的延長，磷含量逐漸下降，當時間達到3 h以后，磷脂酶與油中的磷脂反應完全，磷含量不再發生明顯的變化。因此較好脫膠反應時間為3 h左右。由圖5C可知，在45～55 ℃的范圍內，脫膠油中磷含量均在10 mg/kg以下，說明脫膠的最佳溫度在45～55 ℃之間。過高或過低的溫度均會導致酶活力降低，從而導致脫膠效果不理想。由圖5D可知，在pH 4.5～5.5范圍內，固定化酶活力較高，可以將油脂中磷含量降低到10 mg/kg以下。

2.4.2 響應面試驗結果

2.4.2.1 響應面試驗結果與分析

表3 響應面試驗設計與結果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

如表3所示，以磷含量為響應值Y，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析。回歸模型的方差分析見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table4 Analysis of variance of the regression equation

由表4可知，二次回歸模型的F值為47.11，P值小于0.000 1，說明此回歸模型極顯著；失擬項P值為0.066 5，大于0.05，表明差異不顯著，此模型擬合效果良好，可以接受。一次項、二次項和交互項BD、CD對響應值的影響均為極顯著（P＜0.01），交互項的影響主次順序為BD＞CD。方程決定系數R2值為0.979 2，說明使用此回歸方程進行分析時，各因素與響應值之間有良好的線性關系[26-27]。

從圖6可以看出，反應時間和反應pH值、反應溫度和反應pH值兩兩交互作用的曲線較陡，呈現較規則的曲面，說明交互作用影響顯著，且反應時間和反應pH值交互作用曲面圖較反應溫度和反應pH更為陡峭，說明反應時間和反應pH值交互作用更為顯著。

圖6 兩因素交互作用對磷含量影響的響應面和等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the intereactive effect of variables on phosphorus content of degummed oil

通過Design-Expert 8.0.6獲得的回歸方程為Y=433.21-19.24A-24.05B-6.63C-72.66D＋0.75AB-0.047AC＋0.65AD＋0.07BC＋2.15BD＋0.30CD＋4.33A2＋1.05B2＋0.05C2＋4.5D2。根據此回歸方程，確定固定化磷脂酶用于菜籽毛油脫膠的最佳條件為固定化酶添加量1.79 g/kg、反應時間3.56 h、反應溫度51.22 ℃、反應pH 5.46。

2.4.2.2 驗證實驗結果

根據響應面試驗所得的最佳脫膠條件，進行3 次重復驗證實驗。根據實際操作的需要，將脫膠反應最佳條件修正為固定化酶添加量1.8 g/kg、反應時間3.6 h、反應溫度51 ℃、反應pH 5.5。在此條件下進行固定化酶脫膠實驗，得到的脫膠油中的平均磷含量為5.82 mg/kg，在響應值Y的95%預測區間[4.80，6.45]內，說明此回歸模型具有良好的擬合性。

2.5 固定化酶的重復使用穩定性結果

圖7 固定化酶的重復使用性Fig. 7 Reusability of immobilized phospholipase

由圖7可知，脫膠油中的磷含量隨著固定化酶使用次數增加不斷上升，當固定化酶使用5 次后，磷含量上升為9.78 mg/kg。工業生產中要求，脫膠油的磷含量在10 mg/kg以下[28]，可見固定化酶重復使用5 次后，其脫膠效果仍可滿足工業生產的要求。固定化酶活力隨著使用次數的增加不斷下降，當使用5 次后，固定化酶只含有初始酶活力的47.9%。固定化酶活力急劇下降的原因可能是酶與載體結合不牢固，在脫膠的過程中由于不斷攪拌的緣故，酶從載體上脫落，造成酶活力損失較大[29-30]。

3 結 論

以離子交換樹脂D001為載體固定化磷脂酶A1，最佳固定化反應條件為pH 5.0、酶添加量1.5 mL/g、固定化時間4 h。獲得的固定化磷脂酶A1的活力為665.8 U/g。與游離酶相比，固定化酶的最適溫度和pH值均未發生改變，但固定化反應可以在一定程度上增加酶的穩定性，使固定化酶在更廣的溫度和pH值范圍內保持較高的相對酶活力。將固定化酶用于菜籽油脫膠實驗，并通過響應面試驗優化了脫膠條件。將固定化酶進行5 次脫膠實驗后，脫膠油中磷含量為9.78 mg/kg，滿足工業生產中脫膠油中磷含量小于10 mg/kg的要求，但是固定化酶只有其初始酶活力的47.9%，酶活力損失較大。說明該固定化酶用于油脂脫膠，還是存在著固定化酶重復利用次數較少，酶活力損失較大的問題，還需研究更加有效的固定化方法，使固定化磷脂酶A1實現較多次數的重復使用。實驗表明，使用大孔樹脂固定化磷脂酶A1脫除菜籽毛油中的磷脂，得到的脫膠油完全符合工業生產對脫膠效果的要求，并且可以方便地實現酶的分離和重復利用。

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