宏基因組文庫新型β-葡萄糖苷酶的篩選、克隆及酶學性質分析

唐樂麗，王曉萌，吳秀玲，黃 慶，李 荷*

（廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006）

微生物資源在地球上的含量十分豐富，其中原核細胞數量和種類高達到6×1030～8×1030個[1]，微生物具有的多樣性特質，為挖掘新酶、新的代謝物質和生物活性物質提供了一種新來源[2]。然而Bakken等[3]研究發現，自然界中高達99%的微生物是未培養微生物，即在目前的實驗環境下是不能被培養生長的，如果利用傳統培養微生物學的方法，只能獲得地球上極少數微生物的活性物質，從而興起了宏基因組技術，1985年，Pace等通過提取環境微生物總DNA法，成功研究了大量未培養微生物所攜帶的遺傳學信息，這之后，許多研究者都通過此方法對未培養微生物進行了研究[4-5]。

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21），屬于纖維素酶類，是3 種纖維素分解酶中的重要組成成分之一，它能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。β-葡萄糖苷酶有較廣泛的工業應用，可用來降解纖維素[6-8]生產生物乙醇、改善食品風味、轉化大豆異黃酮糖苷化合物、制備低聚龍膽糖、防治病蟲害[9-11]等。但目前工業用β-葡萄糖苷酶多數來源于木霉等真菌及茶樹類植物[12-13]，反應條件（如溫度、pH值）適應范圍相對較窄，且酶活力偏低，造成經濟成本較高，制約β-葡萄糖苷酶的廣泛應用[14-15]。而且生物酶應用于工業生產的條件比較苛刻，要求生物酶具有良好的熱穩定性、有機溶劑耐受性、金屬離子耐受性以及在特定pH值、溫度條件下的高酶活力，因此需要發掘酶學性質更加優良的β-葡萄糖苷酶來提高工業生產效率，降低生產成本。宏基因組技術研究對象是微生物總DNA并獨立于宿主之外進行研究，所獲得的新基因一般都較完整，相似度也較低，可以用來大量篩選新的有開發前景的工業酶[16-18]。黑龍江玉米秸稈還田土壤中纖維素資源豐富，可能含有能夠產生酶活力較高的β-葡萄糖苷酶微生物。本研究以黑龍江玉米秸稈還田土壤微生物為對象，構建其宏基因組文庫，利用功能篩選方法，擬從文庫中篩選具有酶活力較高的新型β-葡萄糖苷酶基因并對其酶學性質進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣采自黑龍江省牡丹江市郊區玉米秸稈還田土壤，采集表層下10～20 cm的土樣，-20 ℃保存。Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由本實驗室保存。建庫所用載體質粒pUC118、pET-32a（＋）購自大連TaKaRa公司。

XhoⅠ、EcoRⅠ等限制性內切酶、T4 DNA連接酶以及各種DNA MarkerPrime、STARTMMax Premix、蛋白質分子質量Marker 大連TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒（E.Z.N.A?Gel Extraction Kit）、質粒提取試劑盒（E.Z.N.A?Plasmid Mini Kit）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物回收試劑盒（E.Z.N.A?Cycle-Pure Kit） 美國Omega公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranoside，X-gal）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Sigma公司；七葉苷、對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP），對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG） 生工生物工程（上海）有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

凝膠成像系統 美國BioTek公司；電泳儀 北京六一儀器公司；PCR儀 美國AB公司；恒溫水浴鍋上海精密實驗設備公司；電擊儀 美國Bio-Rad公司；Nanodrop2000c超微量紫外-可見光分光光度計 賽默飛世爾科技公司；PB-10型pH計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸稈還田土壤基因組總DNA的提取[19]及純化

取4 個高壓滅菌后的50 mL離心管，稱取玉米土壤樣品，每管6 g，各加DNA 提取緩沖液13.5 mL，渦旋振蕩混勻后，放搖床220 r/min、37 ℃活化30 min。各管加1.5 mL質量濃度20 g/100 mL 的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），使其終質量濃度達到2 g/100 mL。在65 ℃水浴鍋中水浴2 h，每隔30 min上下輕輕顛倒數次混勻。25 ℃、6 000 r/min離心10 min。將上清液轉移至高壓滅菌的50 mL高速離心管，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）混合液，上下輕輕顛倒混勻。25 ℃、11 000 r/min離心30 min。收集上清液，加入0.6 倍體積的異丙醇上下輕輕顛倒混勻，室溫靜置3 h以上。25 ℃、11 000 r/min離心30 min。棄上清液，用4 ℃預冷的75%乙醇溶液洗滌沉淀1 次。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，放入60 ℃烘箱烘干。每管加0.2 mL 65 ℃預熱的ddH2O，并65 ℃溫浴5 min，溶解基因組DNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA，并立即純化回收基因組DNA。提取的粗基因組DNA用1.0%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Omega的DNA Extraction Kit回收并純化所提取的玉米土壤基因組DNA。

1.3.2 玉米秸稈還田土壤宏基因組文庫的構建

選擇EcoRⅠ酶對提取純化的玉米土壤DNA進行不完全酶切80 min，回收2.3～8 kb的DNA片段。將回收的酶切DNA片段連接到線性化的經EcoRⅠ酶切的克隆載體上，用TaKaRa T4 DNA Ligase于16 ℃連接12～16 h。對連接產物進行純化：取出DNA酶切片段與載體的連接產物，加入2.5 倍體積-20 ℃提前預冷的無水乙醇和0.05 倍體積的3 mol/L乙酸鈉輕輕混勻，-20 ℃沉淀1 h以上；4 ℃、12 000 r/min離心20 min；棄上清液，用-20 ℃預冷的70%乙醇溶液輕輕洗滌沉淀2 次。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集管中沉淀，60 ℃烘箱中烘干；加入10 μL 65 ℃預熱的dd H2O重懸連接的載體DNA。將純化的連接產物的電擊轉化法轉入大腸桿菌E. coli DH5α感受態細胞。取適量培養物涂布于LAXI培養基（100 mg/L Amp、20% IPTG和20 mg/L X-gal），37 ℃培養過夜，即得玉米土壤宏基因組文庫。

1.3.3 土壤宏基因組文庫β-葡萄糖苷酶的篩選

挑選白色菌落，剔除藍色菌落，點到β-葡萄糖苷酶篩選培養（100 μg/mL Amp、0.25%檸檬酸鐵銨、0.1%七葉苷）平板上，37 ℃培養24 h，觀察菌落周圍是否有黑色水解圈，有黑色水解圈的菌落為β-葡萄糖苷酶陽性克隆子[20]。

1.3.4 測序及序列的生物信息學分析

1.3.4.1 ORF Finder

挑選轉化后仍然具有黑色透明圈的克隆子，提取質粒，EcoRⅠ單酶切，若仍舊能夠切出載體和目的DNA條帶，則將重組質粒送到Invitrogen公司進行序列測定。將測序得到的目的DNA序列用NCBI的ORF Finder在線工具查找該序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF），再將ORF序列經pBlast逐一比對，得到序列與已報道的功能蛋白的相似度等信息。

1.3.4.2 系統發育樹和氨基酸保守性分析[21-22]

將疑似功能蛋白的基因與已報道的該蛋白各家族成員序列先用Clustal W軟件比對序列并導出序列對比結果，再用MEGA 4.0軟件中Unrooted Neighbor-Joining Method，the Bootstrap Test選擇（1000 replicates）構建系統發育樹，得到基因的種屬信息和與已報道基因的親緣關系。

1.3.4.3 等電點、信號肽等性質分析

用在線分析軟件ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸等電點、半衰期、分子質量、不穩定系數和親疏水性等。用TMHMM 2.0和SignalP 4.1 servers，分析氨基酸的跨膜區和信號肽序列。用SOPMA預測蛋白的二級結構。

1.3.5 bgl2238基因的PCR擴增與重組菌株的表達

根據測序結果設計一對引物：bgl2238-F和bgl2238-R，引物兩端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物序列如下：bgl2238-fw：5′-CCGGAATTCATGAAAC ACATCCTAAACCTATGCC-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；bgl2238-rv：5′-CCGCTCGAGTTATCGTACG CTAAAAGTAAGGGCTTC-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。引物由Invitrogen公司合成；以包含pUC118-bgl2238的質粒為模板，采用Prime STARTMMax Premix進行PCR擴增，PCR回收試劑盒對擴增產物進行純化回收。

分別用XhoⅠ和EcoRⅠ將純化后的PCR產物和載體pET-32a（＋）進行雙酶切，用PCR回收試劑盒純化雙酶切產物，采用T4 DNA Ligase對雙酶切處理的pET-32a（＋）及PCR產物16 ℃連接12～16 h，直接轉化E. coli BL21（DE3）。隨機挑取轉化子經培養后，提取其質粒并雙酶切驗證。挑取酶切驗證正確的轉化子于37 ℃搖床中培養，當OD值達到0.8左右時，加入IPTG，使其終濃度為1.0 mmol/L，25 ℃誘導表達11 h，收集菌體，超聲破碎菌體后得粗酶液。粗酶液采用His·Bind?Resin試劑盒進行純化。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力的測定

將重組菌株接種于裝有20 mL LB液體培養基中，25 ℃、220 r/min培養11 h，取菌液3 mL，6 000 r/min離心20 min，棄上清液，用冰預冷的無菌dd H2O洗滌沉淀兩次，再用4 mL dd H2O重懸細胞沉淀，超聲波破碎菌液直至變清，即為粗酶液。取10 μL一定稀釋倍數的粗酶液、80 μL最適pH值的B-R緩沖液、50 mmol/L的pNPG 10 μL混合，最適溫度下水浴20 min，取200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止酶促反應，取上述混合物200 μL，測定OD405nm。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘分解pNPG產生1 μmol pNP所需的酶量。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈還田土壤總DNA的提取及純化

圖1 土壤基因組DNA的瓊脂糖電泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of soil genomic DNA

通過直接提取法獲得玉米秸稈還田土壤基因組DNA，結果如圖1所示，基因大小片段集中在15 kb以上，大約是23～30 kb之間，拖尾現象不明顯，只有極少量DNA被降解，表明直接提取法獲得的基因組DNA質量非常好，滿足建庫的需要。

2.2 土壤宏基因組文庫的評估

將擴大酶切后的土壤基因組DNA與載體連接，電擊轉化入大腸桿菌E. coli DH5α，構建宏基因組文庫，隨機挑取16 個白色克隆子，EcoRⅠ酶切驗證插入片段的大小，有14 個克隆子含有不同插入片段，文庫陽性克隆率較高，重組率為87.5%，文庫插入片段大小0.8～8.0 kb，該文庫含有大約5 500 個陽性克隆子，其插入片段平均長度在4.5 kb左右，片段特異性較好。

2.3 土壤宏基因組文庫中β-葡萄糖苷酶的篩選

利用底物七葉苷功能篩選法，對宏基因組文庫進行初步篩選，從構建的宏基因組文庫5 500 個克隆子中，發現1 個克隆子在七葉苷平板上有黑色水解圈，初步確定其具有β-葡萄糖苷酶活性，編號為44號克隆子，如圖2所示。后期通過提質粒、酶切驗證后送Invitrogen公司測序。

圖 2β-葡萄糖苷酶陽性克隆子的篩選Fig. 2 Screening of positive clones with β-glucosidase activity

2.4 測序及生物信息學分析

2.4.1 NCBI的ORF Finder

將44號克隆子的質粒送交Invitrogen公司進行測序，測序結果顯示44號克隆子基因序列全長為2 470 bp。利用NCBI網站中Sequence Analysis的在線查找工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對此序列進行ORF查找，從2 470 bp的插入片段中發現一個β-葡萄糖苷酶編碼基因的ORF序列，該ORF基因序列全長2 238 bp，編碼745 個氨基酸，基因命名為bgl2238，預測其蛋白分子質量為80.67 kDa，序列已提交至NCBI核酸數據庫（GenBank），登錄號為KU320675。經NCBI的BlastP在線序列比對分析，發現bgl2238基因序列所編碼的蛋白bgl2238含有GH3超家族和GH3C超家族的結構域（圖3），其與來源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶（GenBank：WP_048691945.1）具有58%的相似性。

圖3 推測的bgl2238的保守序列區域Fig. 3 Putative conserved domains of bgl2238

2.4.2 系統發育樹

使用生物信息學軟件Clustal W和MEGA 4.0對bgl2238與親源性較近的蛋白質進行系統發育樹的構建，結果如圖4所示，可以看出，bgl2238與來源于Alistipes CAG: 435和未培養微生物（登錄號：AAZ32298.1）的β-葡萄糖苷酶親緣關系較近，與其他來源的β-葡萄糖苷酶親緣關系都較遠。

圖4 bgl2238與親緣性較近蛋白的系統發育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of bgl2238

2.4.3 bgl2238的氨基酸序列、二級結構分析

用生物信息學方法預測bgl2238的蛋白分子質量、等電點PI、半衰期、不穩定系數和親疏水性等基本理化性質、氨基酸跨膜結構域和信號肽序列見表1，信號肽序列分析結果見圖5，二級結構見圖6。

表1 bgl2238的氨基酸性質分析Table1 Amino acid properties of bgl2238

由表1可知，bgl2238的pI值為4.95，屬酸性蛋白質，蛋白結構較穩定，疏水性高，位于細胞膜外且無信號肽序列。

圖5 預測的蛋白bgl2238信號肽分析Fig. 5 Signal peptide analysis prediction of protein bgl2238

圖6 預測蛋白bgl2238的二級結構Fig. 6 Secondary structure prediction of protein bgl2238

不同的mRNA結構可能編碼不同的蛋白質二級結構，翻譯慢的mRNA區域傾向于編碼β折疊、無規則卷曲結構，翻譯快的mRNA區域更傾向于編碼α螺旋結構。由圖6可知，bgl2238的二級結構中，α螺旋結構占37.05%，無規卷曲結構為49.93%，延伸片層結構占13.02%，說明蛋白bgl2238的mRNA翻譯較快。

2.5 bgl2238基因克隆與表達

圖7 基因bgl2238的PCR擴增產物Fig. 7 Amplified products of gene bgl2238

以pUC118-bgl2238重組質粒為模板，以bgl2238-F和bgl2238-R為引物進行PCR擴增，得到一條非常明顯的DNA條帶，大小位于2 000～3 000 bp之間，與預期基因大小2 238 bp一致（圖7）。重組質粒pET-32a（＋）-bgl2238直接化轉E .coli BL21（DE3）感受態細胞，對重組菌株誘導表達得粗酶液。對粗酶液進行純化，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在大約100 kDa處出現了目標條帶（圖8），與理論計算得到β-葡萄糖苷酶分子質量大小（80.67 kDa）加上分子標簽（18.15 kDa）相符合。

圖8 bgl2238蛋白純化SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig. 8 SDS-PAGE analysis of recombinant bgl2238

2.6 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶學性質分析

2.6.1 pH值對酶活力及穩定性的影響

圖9 pH值對β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及穩定性的影響Fig. 9 Effect of pH value on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

保持反應溫度為44℃，不同pH值緩沖液中（1.98、2.87、4.10、5.02、6.09、6.59、7.0、7.54、7.96、8.95、9.91、10.88、11.82），測定β-葡萄糖苷酶bgl2238活力，獲得一級pH值梯度下的最適pH值范圍后，將pH值梯度進一步縮小，以最終獲得酶最適反應pH值。將經pH 2.0～12.0緩沖液稀釋的粗酶液4 ℃放置4 h后，測定剩余酶活力。將最適pH值下未經4 h孵育的最高酶活力定義為100%。結果如圖9所示，bgl2238酶的最適反應pH值為6.10，用pH 6.09～6.59緩沖液處理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力，酶促反應的pH值范圍較窄，在偏酸和偏堿性環境下bgl2238的酶活性和穩定性都很低，表明bgl2238屬于一種偏中性酶。

2.6.2 溫度對酶活力及穩定性的影響

于最適pH值的B-R緩沖液中，分別置于4、15、30、40、45、50、60、70 ℃和80 ℃水浴中進行酶活力測定，獲得一級溫度梯度下的最適溫度范圍，再將溫度梯度進一步縮小，以獲得酶最適反應溫度。將適當稀釋的粗酶液分別放于4～80 ℃不同水浴中保溫4 h，測定剩余酶活力。以未經熱處理（4 ℃）的酶液的酶活力定為100%。結果如圖10所示，bgl2238酶促反應的最適溫度為44 ℃，在32～44 ℃范圍內，酶活力隨溫度的升高而增大，44 ℃后，酶活力隨溫度上升而急劇下降，至60 ℃時bgl2238完全失活；在4～50 ℃之間不同溫度下熱處理bgl2238 4 h，發現bgl2238仍保留70%以上的酶活力，表明β-葡萄糖苷酶活力在50 ℃以下穩定性良好。在44 ℃、pH 6.10時bgl2238酶活力最高，計算其酶活力為29.1 U/mg。

圖10 溫度對β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及穩定性的影響Fig. 10 Effect of temperature on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

2.6.3 金屬離子對酶活力的影響

在80 μL含金屬離子終濃度分別為1 mmol/L或10 mmol/L的最適pH值緩沖液中加入10 μL經稀釋的粗酶液，4 ℃放置4 h后，于最適溫度條件下測定剩余酶活力。將未加金屬離子的酶促反應中酶活力定義為100%。如圖11所示，不同濃度的K＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋、Co2＋和Ni2＋對酶活力均有促進作用，其中Fe2＋對bgl2238酶活力的促進作用最大，10 mmol/L Fe2＋使相對酶活力高達260%，增加至酶的原始活性的2 倍多，而重金屬離子Ag＋、Hg2＋及Cu2＋對酶活力有強烈抑制作用。

圖11 金屬離子對β-葡萄糖苷酶bgl2238活性的影響Fig. 11 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase bgl2238

2.6.4 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶促動力學分析

以pNPG為底物，將粗酶液稀釋50 倍，利用Lineweaver-Burk雙倒數法測定bgl2238的米氏常數，以1/V為縱坐標、1/[S]為橫坐標作圖，曲線與x軸相交的點為-1/Km，與y軸相交的點為1/Vmax。結果如圖12所示，β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG為底物時，Vmax=576 μmoL/（L·min），Km= 0.296 mmol/L。

圖12 β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG為底物的動力學參數Fig. 12 Lineweaver-Burk plot for β-glucosidase bgl2238 with pNPG as substrate

3 結 論

宏基因組技術通過基因克隆、序列篩選或者功能篩選法、基因表達等手段，避開了絕大多數微生物難以分離培養的問題，為挖掘新型生物催化劑開辟了新途徑[23-29]。本研究篩選到的β-葡萄糖苷酶bgl2238經測定，最適pH值為6.10，用pH 6.09～6.59緩沖液處理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力，表明bgl2238屬于一種偏中性酶，在生產過程中只需保持酶促反應的pH值在中性附近即可，對生產設備的酸堿度耐受性要求低，節約成本。β-葡萄糖苷酶bgl2238最適溫度為44 ℃，當酶促反應溫度升高到50 ℃時，相對酶活力不足40%，說明此酶不耐高溫。不同的金屬離子影響酶的活性，目前大約35%已知酶在金屬離子存在下活性增加[30-31]，金屬離子通過與帶負電的氨基酸殘基結合而增加酶結構的穩定性。本研究中不同濃度的幾種金屬離子對β-葡萄糖苷酶bgl2238活力均有激活作用，其中Fe2＋對酶活力的促進作用最大，10 mmol/L Fe2＋使相對酶活力高達260%，增加至酶的原始活性的2 倍多，利用β-葡萄糖苷酶bgl2238這一特性，向酶促反應體系中加入適當濃度的K＋、Na＋、Fe2＋可以明顯提升bgl2238的酶活力，從而避免某些酶因嚴重依賴一些金屬離子（如Mg2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ca2＋、Co2＋、Zn2＋和Ni2＋等）而造成的金屬環境污染。為使得bgl2238能夠更好、更廣泛地應用于工業生產，后期可通過易錯PCR對β-葡萄糖苷酶bgl2238進行改造并構建突變文庫，以期獲得對溫度和pH值耐受性更好的酶。

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