瓦氏雅羅魚殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

李 博 何亞鵬 劉 寧

瓦氏雅羅魚，又被稱為華子魚、白魚，是鯉科、雅羅魚亞科、雅羅魚屬的代表魚類。瓦氏雅羅魚最適宜的水質為弱堿性，水溶氧量應高于5 mg/L，透明度在30 cm左右。在這樣的水域中，瓦氏雅羅魚能保持較好的生長狀態[1]。由于捕撈強度的增加、生態環境的變遷以及疫病的影響，瓦氏雅羅魚的數量逐漸減少，瓦氏雅羅魚作為北京土著魚類，是北京市二級保護魚類，其資源現狀堪憂。

殺鮭氣單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，隸屬于氣單胞菌屬氣單胞菌科。該菌在全球范圍內分布廣泛，可引起鮭魚科魚類的“癤瘡病”和“敗血癥”，典型臨床癥狀為魚體表面多處潰爛。近年來，研究發現殺鮭氣單胞菌也可感染其他魚類，如鯉科魚類，該菌還可與其他細菌混合感染，對鮭魚科和鯉科魚類危害很大[2]。本試驗從北京市水生野生動植物救護中心馴養車間患病的瓦氏雅羅魚體內分離純化出1株殺鮭氣單胞菌，然后對其進行了理化特性、分子生物學特性及耐藥性分析，并根據藥敏試驗結果選擇用藥，有效地對瓦氏雅羅魚進行了救護。

1 材料與方法

1.1 材料 患病的瓦氏雅羅魚來源于北京市水生野生動植物救護中心馴養車間。營養瓊脂培養基、生化鑒定試劑和藥敏紙片均購自北京賽為思生物技術開發中心，細菌DNA提取試劑盒（DP302）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離 取患病的瓦氏雅羅魚，在超凈工作臺內采集內臟，劃線接種于營養瓊脂培養基上，28 ℃細菌培養箱內培養20 h，觀察形成的菌落的形態、顏色和大小等。將分離菌進行革蘭染色，在顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 生理生化鑒定 將菌株分別在無菌條件下穿刺接種于細菌生化鑒定管中，根據《常見細菌系統鑒定手冊》對該菌株進行系統的理化特性測定[3]。

1.2.3 16S rDNA基因的擴增 采用16S rDNA通用引物（上游16SF：5’-CTAAGCCAGGATCAAACTCT-3’；下游16SR：5’-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’）。 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的DNA作為模板，按常規PCR方法進行擴增。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶大小。陽性樣品由華大基因公司測序。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B法對分離菌株的藥物敏感性進行檢測。將培養16 h的該分離菌菌液涂布在檢測平板上，平板于室溫中放置4 min等待干燥，在合適區域貼上藥敏紙片，室溫放置10 min后，倒置于28 ℃細菌培養箱內培養18 h，在黑色無反光的背景下測量包括紙片直徑在內的抑菌圈直徑，判定該菌的藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀 患病的瓦氏雅羅魚鱗片大面積脫落，身體表面存在多處出血，鰓蓋和眼周出血，尾部有潰爛。

2.2 細菌形態 營養瓊脂培養基上的菌落為圓形、不透明、表面光滑、隆起及邊緣整齊，菌落為中等大小。染色鏡檢發現該菌為革蘭氏陰性的短桿狀細菌。

2.3 理化特性 由分離菌的生化鑒定結果可知，該菌株不具有動力性，枸櫞酸鹽、氧化酶、鳥氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、賴氨酸脫氫酶、尿素、蔗糖和VP試驗均為陰性，半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷和葡萄糖試驗為陽性。根據《常見細菌系統鑒定手冊》，將其初步判定為殺鮭氣單胞菌。

2.4 16S rDNA的擴增結果及序列分析 以分離細菌的DNA為模板，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增得到約1 500 bp的核酸片段（見圖1）。將分離菌的測序結果用GenBank中的BLAST工具進行序列比對，結果表明該序列和殺鮭氣單胞菌的殺鮭亞種代表株相似性在99%以上，表明該菌株為殺鮭氣單胞菌。

圖1 PCR擴增結果

2.5 藥敏試驗結果 藥敏試驗表明，該分離菌株對強力霉素、阿米卡星等抗生素敏感，對利福平、紅霉素、環丙沙星、諾氟沙星等中度敏感，對青霉素、甲氧卞胺嘧啶、卡那霉素等藥物耐受。

2.6 用藥結果 根據上述藥敏試驗結果，選擇強力霉素和阿米卡星拌料治療，同時在池水中加入抗菌中草藥，對發病的魚池采用聚維酮碘消毒，短時間內有效地控制了該疫情。

3 討論

殺鮭氣單胞菌可引起鮭魚科、鯉科等魚類產生皮膚潰爛等癥狀，以至出現敗血癥、死亡，對魚類養殖和魚種保護造成嚴重的損失［4-5］。本試驗中瓦氏雅羅魚感染殺鮭氣單胞菌的原因可能是魚剛到新的水體環境中，由于應激和飼養模式變化等原因，導致魚的抵抗力下降，從而感染該菌，導致疾病。動物養殖過程中常選用抗生素進行細菌性疾病的防治，但其選擇和使用需要有科學性，長期不合理使用同種藥可誘導病原菌產生耐藥性，藥物會失去作用，動物體內也會有大量藥殘。因此，在選擇藥物前需要做好藥敏試驗，合理慎重用藥。本研究可為進一步研究殺鮭氣單胞菌的防治奠定基礎，為殺鮭氣單胞菌感染的臨床用藥提供參考。

[1]孟和平，韓國蒼，高玉奎，等．達里湖鯽魚、瓦氏雅羅魚資源的可持續發展[J]．當代畜禽養殖業，2015（10）：48．

[2]王海娟，王利．鯉魚殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國畜牧獸醫，2015（1）：192-196．

[3]蔡妙英，東秀珠．常見細菌系統鑒定手冊[M]．北京：科學出版社，2001：364-399．

[4]劉寧，時曉，杜迎春，等．患病細鱗魚殺鮭氣單胞菌的分離與鑒定[J]．淡水漁業，2015（1）：88-92．

[5]王家禎，耿昕穎，董文龍，等．3株殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]．中國獸醫雜志，2017（2）：78-80．