陰虛證、水腫證、陰虛水腫證中醫(yī)動(dòng)物模型的造模方法及評(píng)價(jià)※

徐文峰范元碩何澤云唐 群彭亞軍李旭華

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

證候病理研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分，中醫(yī)證候動(dòng)物模型又是中醫(yī)藥研發(fā)和辨證論治機(jī)理研究的重要手段。動(dòng)物模型的穩(wěn)定性、可重復(fù)性是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究結(jié)果的真實(shí)性、可靠性、創(chuàng)新性的基本前提[1-2]。以腎內(nèi)科常見(jiàn)臨床癥狀水腫為例，臨床常有水腫與傷陰并見(jiàn)之象，此陰虛水腫以發(fā)汗、利尿、健脾、溫腎等法難以奏效，水腫遷延難愈，目前有關(guān)陰虛水腫的理論探討、機(jī)理研究相對(duì)較少，有關(guān)動(dòng)物模型報(bào)道亦少。本文旨在從模擬中醫(yī)病因的動(dòng)物模型、模擬西醫(yī)病因病理的動(dòng)物模型兩方面探討水腫、陰虛證動(dòng)物模型造模現(xiàn)狀，總結(jié)陰虛水腫證動(dòng)物模型的相對(duì)合理造模方式。

1 陰虛證動(dòng)物模型

1.1 中醫(yī)病因病機(jī)造模方法

1.1.1 單因素造模

1.1.1.1 超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)法 《本草經(jīng)解》：“七傷者食傷、憂(yōu)傷、飲傷、房室傷、饑傷、勞傷、經(jīng)絡(luò)營(yíng)衛(wèi)氣傷之七傷也。七傷皆傷真陰”，過(guò)勞傷及真陰而致陰精耗損。吳柳花等[3]、汪泳濤等[4]將實(shí)驗(yàn)大鼠在水深、水溫恒定環(huán)境下游泳6～8周，每周5天，每天1次，日游泳時(shí)間由10 min逐日增加至第五周末的120 min（或第7周末180 min），建立大鼠“陰虛內(nèi)熱證”模型。此法在病因上更接近臨床。

1.1.1.2 長(zhǎng)期激怒法 《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》曰：“暴怒傷陰”。刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使其長(zhǎng)期處于躁怒狀態(tài)，模擬因情志失調(diào)，肝郁化火，久而傷陰以建造肝腎陰虛型動(dòng)物模型。俸道榮等[5]將雄性SD大鼠雙后肢束縛，成對(duì)倒吊于籠內(nèi)，激怒實(shí)驗(yàn)大鼠，使其粗叫、嘶咬等，首次激怒20 min，以后每隔1天，增加激怒時(shí)間10 min，直至激怒時(shí)間達(dá)到40 min。隨著天數(shù)增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少，具體表現(xiàn)為扎堆、倦臥、嗜睡等，同時(shí)表現(xiàn)出拱背、胡須下垂、叫聲細(xì)、毛無(wú)光澤、大便干燥、易激怒等，認(rèn)為動(dòng)物已處于“暴怒傷肝”“暴怒傷陰”狀態(tài)。

1.1.1.3 藥物損傷法 根據(jù)中醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)“陰陽(yáng)對(duì)立”理論，以附子、干姜、肉桂等辛溫燥烈之陽(yáng)藥，因“陽(yáng)勝則陰病”“火熱灼津，營(yíng)陰暗耗”而使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物陰液虧虛，造成陰虛模型。韓冰冰等[6]以制附片、干姜、肉桂等復(fù)合煎劑灌胃14天建立陰虛內(nèi)熱大鼠模型。此法操作簡(jiǎn)便，過(guò)程易量化控制，模型“內(nèi)熱”及“內(nèi)燥”表現(xiàn)明顯，虛熱證陰虛內(nèi)熱的分子機(jī)制可能與刺激應(yīng)答相關(guān)基因及固醇代謝相關(guān)基因兩類(lèi)基因的異常表達(dá)相關(guān)。

1.1.1.4 逐水傷陰法 中醫(yī)認(rèn)為“水火者，陰陽(yáng)之征兆也”，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物減少水入，增加排出，使其處于“缺水”狀態(tài)，造成津虧內(nèi)燥傷陰，表現(xiàn)陰虛內(nèi)熱的證候。馮志毅等[7]在家兔禁食禁水18 h后由耳緣靜脈注射呋塞米注射液，1 h后同法注入等量呋塞米注射液，再過(guò)1 h后由耳緣靜脈注射大腸桿菌造模。造模后家兔出現(xiàn)煩躁、氣促、大便干燥、耳廓發(fā)紅發(fā)熱、舌紅少津、體溫升高等陰虛癥狀相似表現(xiàn)。但此模型穩(wěn)定性差，脫水癥狀糾正后，諸癥改善，與中醫(yī)“陰虛難復(fù)”的臨床表現(xiàn)不符。

1.1.1.5 高鹽飲食法 《黃帝內(nèi)經(jīng)》篇云：“夫鹽之味咸，其氣令津泄”“咸走血，咸者腎之味”。中醫(yī)五行學(xué)說(shuō)認(rèn)為：腎在味主咸，高鹽飲食的持久攝入，可耗液傷津，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)血壓升高、躁動(dòng)、大便干燥等陰虛陽(yáng)亢表現(xiàn)。姜麗芳等[8]予Wistar大鼠高鹽飼料 (含食鹽9%)，同時(shí)飲用水初始予自來(lái)水，30 d后改為0.9%鹽水，共喂飼150 d造模。造模后測(cè)量大鼠清醒安靜狀態(tài)時(shí)的尾動(dòng)脈血壓，模型組明顯高于正常飲食組，綜合大鼠癥狀表現(xiàn)，考慮其為“高血壓陰虛陽(yáng)亢證”模型。

1.1.2 多因素復(fù)合造模

1.1.2.1 特殊環(huán)境法 凌昌全等[9]將大鼠置于人工氣候室內(nèi)（干球40℃、濕球32℃）進(jìn)行熱應(yīng)激3 h處理，大鼠表現(xiàn)為昏睡，耳、爪、尾等潮紅，大量流涎，氣促等，考慮可將其視為“熱損傷陰證模型”。此法僅通過(guò)大鼠表象的變化進(jìn)行評(píng)述造模結(jié)果，缺乏客觀檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)支持，故造模準(zhǔn)確性有待商榷。

1.1.2.2 番瀉葉結(jié)合運(yùn)動(dòng)法 易杰等[10]選取雌/雄SD大鼠，飲食上予給番瀉葉致瀉，同時(shí)加以游泳運(yùn)動(dòng)，造模1月。實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)消瘦、倦怠、大便稀等表現(xiàn)，考慮為“脾陰虛證”模型。

1.1.3 中醫(yī)病因病機(jī)造模方法的評(píng)價(jià) 中醫(yī)病因病機(jī)造模法，是以中醫(yī)證候?yàn)橛^測(cè)指標(biāo)，中醫(yī)病因病機(jī)理論為操作指導(dǎo)，通過(guò)非藥物等干預(yù)，研制臨床動(dòng)物模型的方法。所研制模型具有貼近中醫(yī)病因現(xiàn)實(shí)的優(yōu)勢(shì)，與中醫(yī)證候表現(xiàn)吻合度高。但因?yàn)橹嗅t(yī)病因病機(jī)概念的不確定性、證候與病因間因果關(guān)系的多元性，以及造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體間物種的差異性、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異性，使該大類(lèi)下所造模型可量化數(shù)據(jù)缺乏，造模過(guò)程中操作人員主觀意識(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程影響較大，成功率、穩(wěn)定性較低，可重復(fù)性差，有待進(jìn)一步研究、解決。

1.2 西醫(yī)病因病理造模方法

1.2.1 甲狀腺激素類(lèi)造模法 此法通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入甲狀腺激素類(lèi)藥物[甲狀腺片、三碘甲腺原氨酸（T3）和左旋甲狀腺素鈉（T4）]，模擬甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀，出現(xiàn)怕熱、多汗、神經(jīng)過(guò)敏、急躁、震顫、心率加快、心輸出量增加等類(lèi)似于陰虛的現(xiàn)象。李慧芬等[11]取雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后稱(chēng)定質(zhì)量，每天灌服20 mg/kg甲狀腺片 (以甲狀腺素計(jì))誘導(dǎo)腎陰虛模型，連續(xù)24 d。造模后實(shí)驗(yàn)大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)疏松，粗糙無(wú)光澤，精神萎靡，拱背少動(dòng)，納食減少，體質(zhì)量下降等體征，考慮“腎陰虛”模型造模成功；毛連根等[12]對(duì)大鼠每天腹腔注射5%T3(0.2 mL/100 g)連續(xù)多日制備“陰虛”模型。

1.2.2 腎上腺皮質(zhì)類(lèi)激素法 此法通過(guò)讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被攝入氫化可的松、地塞米松等糖皮質(zhì)激素，模擬臨床使用腎上腺皮質(zhì)類(lèi)激素后出現(xiàn)的副反應(yīng)建立“陰虛”動(dòng)物模型。戴冰等[13]對(duì)KM小鼠先予以每天0.02 mL/g蒸餾水灌胃，連續(xù)6 d，第7～10天，按50 mg/kg給予氫化可的松灌胃，自由飲水、飲食，造模共持續(xù)10 d，造模后小鼠出現(xiàn)煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁、易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等陰虛癥狀。

1.2.3 甲狀腺素類(lèi)聯(lián)合利血平造模法 此法與甲狀腺激素類(lèi)造模法類(lèi)似，通過(guò)讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入甲狀腺激素類(lèi)藥物[甲狀腺片、三碘甲腺原氨酸（T3）和左旋甲狀腺素鈉（T4）]和利血平模擬甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀。鄔林祥等[14]將昆明雌性小鼠體質(zhì)量（30±29） g，以利血平15 μg/只+甲狀腺素25 μg/只，灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少，飲水增多，體重減輕，躁動(dòng)不安，易驚，后期出現(xiàn)視力障礙等，確定造模成功。

1.2.4 手術(shù)法 廖圣寶等[15]將實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)腹膜后近主動(dòng)脈側(cè)分離左腎動(dòng)脈，以0.2 mm銀莢狹窄左腎動(dòng)脈，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓較術(shù)前升高22.6 mmHg以上，且超過(guò)135 mmHg者，為陰虛證造模成功 (二腎一夾高血壓)。

1.3 西醫(yī)病因病理造模方法的評(píng)價(jià) 陰虛證西醫(yī)病因病理造模法是通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)干預(yù)手段，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)固定方向機(jī)體損傷，進(jìn)而表現(xiàn)中醫(yī)陰虛證候表現(xiàn)，操作簡(jiǎn)便，造模數(shù)據(jù)客觀，可重復(fù)性高，且根據(jù)中醫(yī)理論，予相應(yīng)藥物反證模型成立。但中醫(yī)證候與西醫(yī)臨床診斷關(guān)系是非充分必要性的，是不可逆的。采用西醫(yī)病因病理造模的動(dòng)物模型在理論方面與中醫(yī)傳統(tǒng)理論脫節(jié)，單純的理化、生物損傷因素使模型對(duì)中醫(yī)證候的表達(dá)局限化、片面化。因此西醫(yī)病因病機(jī)理論指導(dǎo)下研制的動(dòng)物模型，適合特定情況下中醫(yī)證候及治療的研究，如甲狀腺功能亢進(jìn)患者表現(xiàn)為陰虛證時(shí)的生化、治療的研究，但用于單純中醫(yī)證候方面的實(shí)驗(yàn)研究，易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)片面，大數(shù)據(jù)真實(shí)性降低。

2 水腫證動(dòng)物模型

中醫(yī)認(rèn)為水腫是由外感、內(nèi)傷等多種因素造成肺脾腎三臟對(duì)水液宣化輸布功能失調(diào)，致使體內(nèi)水液潴留，外溢于肌表引起，臨床常見(jiàn)于風(fēng)水泛濫、濕毒浸淫、氣滯水停、脾陽(yáng)虛衰、氣陰兩虛等證候[16]，查閱近10年文獻(xiàn)，單純依靠中醫(yī)理論指導(dǎo)，難以短期內(nèi)復(fù)制出適用的水腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。西醫(yī)病因病理指導(dǎo)下的模型研制，具有簡(jiǎn)便、高效、重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)，故水腫模型多采用西醫(yī)造模方法。目前常用造模方法為阿霉素法，即通過(guò)讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入一定量的阿霉素，引起全身性水腫。周寧等[17]將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后尾靜脈注射阿霉素，首次劑量為4 mg/kg，8天后再次尾靜脈注射阿霉素3.5 mg/kg。造模后模型大鼠的血肌酐、尿素氮和尿蛋白水平較正常組顯著升高，同時(shí)出現(xiàn)低蛋白血癥，提示造模后大鼠腎功能受損伴水腫癥狀。

此法簡(jiǎn)便、可行，成功率高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量化程度高，可重復(fù)性好。但阿霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響是非特異性的，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的損傷亦是多方面的，如臨床亦有用阿霉素法研制心源性水腫動(dòng)物模型的報(bào)道[18]，故現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中，應(yīng)盡量加強(qiáng)對(duì)可變因素的控制，同時(shí)綜合考慮諸因素間相關(guān)性。

3 陰虛水腫證造模方法

目前常用造模方法是阿霉素聯(lián)合甲狀腺激素類(lèi)方法，此方法通過(guò)復(fù)合藥物刺激，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同時(shí)具有水腫和陰虛的表現(xiàn)。王洪玉[19]將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每日按照15 mg/100 g體重給予甲狀腺素混懸溶液灌胃，自由飲水、飲食，連續(xù)21 d。第一天按照4 mg/kg體重首次尾靜脈注射阿霉素溶液，7 d后同樣的方法按照3.5 mg/kg體重第2次注射，注射5 d后檢測(cè)24 h尿蛋白陽(yáng)性為模型成功的標(biāo)志。

陰虛水腫證動(dòng)物模型，是病證結(jié)合動(dòng)物模型的一種，此類(lèi)模型是確定方向下中醫(yī)證候動(dòng)物模型，具有（1）貼近中醫(yī)證候特點(diǎn)；（2）穩(wěn)定性、可靠性及可重復(fù)性強(qiáng)，以西醫(yī)疾病模型為基礎(chǔ)，造模結(jié)果數(shù)據(jù)化高，彌補(bǔ)了中醫(yī)傳統(tǒng)病因致病的模糊性、非特異性及不可控性缺點(diǎn)；（3）臨床實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。是特定方向中醫(yī)證候研究的理想化模型。將中醫(yī)很多“證”的不確定因素由于“病”的限制變得更加清晰，可廣泛適用于疾病中醫(yī)證候現(xiàn)代本質(zhì)的研究、中西醫(yī)綜合治療研究等，能更精確地闡明中醫(yī)證的本質(zhì)。但此類(lèi)模型的不足也十分明確，無(wú)法準(zhǔn)確反映中醫(yī)理論下疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

4 總結(jié)

陰虛水腫證因其臨床病例較少、治療難度大、治療經(jīng)驗(yàn)記載有限等特點(diǎn)，因此陰虛水腫證動(dòng)物模型的建立，成為臨床研究中的重要部分。在現(xiàn)有三大模型建立思路下，以中醫(yī)病因病機(jī)為指導(dǎo)的造模方法，動(dòng)物模型更接近臨床證候，但受中醫(yī)病因的不確定性、證候表現(xiàn)的主觀性大、動(dòng)物與人物種的差異性、實(shí)驗(yàn)個(gè)體的差異性等影響，使模型穩(wěn)定性、量化性差，可重復(fù)性低，不利于大范圍臨床試驗(yàn)和數(shù)據(jù)化分析；以西醫(yī)病因病理為指導(dǎo)的造模方法，雖穩(wěn)定性、可重復(fù)性、造模數(shù)據(jù)量化性高，短時(shí)間內(nèi)大量穩(wěn)定復(fù)制，但基于中醫(yī)證候與西醫(yī)臨床表現(xiàn)間非必要充分關(guān)系，使模型難于完整表現(xiàn)中醫(yī)證候，不利于中醫(yī)證候的全面性研究；基于中西醫(yī)雙重理論基礎(chǔ)指導(dǎo)下的病證結(jié)合動(dòng)物模型，兼具現(xiàn)代動(dòng)物模型穩(wěn)定性高、可重復(fù)性高等試驗(yàn)要求，同時(shí)具有中醫(yī)證候的癥狀體征表現(xiàn)，雖模型具有特定指向條件下中醫(yī)證候表現(xiàn)的特征，且無(wú)法反映中醫(yī)理論下疾病的發(fā)生發(fā)展等病理過(guò)程、病證傳變等，但與現(xiàn)階段中醫(yī)證候臨床研究思路契合度高，是現(xiàn)階段中醫(yī)證候試驗(yàn)動(dòng)物模型造模方法的不二選擇。