動物類中藥鑒定技術(shù)研究進展

許 燕 肖洪賀 段雙蕊 謝 明

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

動物類中藥應用歷史悠久，早在中醫(yī)經(jīng)典著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》和《傷寒論》中就記載了使用烏蜊骨、水蛭、牡蠣等動物藥組方治病的例子?，F(xiàn)存最早的藥物學專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中則收載有白僵蠶、羚羊角、麝香等67種動物藥，占藥物總量的18.36%，《唐本草》和《本草綱目》中分別收載動物藥128種、461種；而當代《中華本草》和《動物本草》中收載的動物藥更是高達1051種和1731種[1]。2015版《中國藥典》收載51味動物藥藥材，含動物藥的成方制劑461味，占成方制劑和單味制劑總量的30.9%[2]。由此可見，動物類中藥一直備受醫(yī)藥學家和政府部門的重視，是中醫(yī)藥學遺產(chǎn)中的重要組成部分。同時，由于動物藥富含蛋白質(zhì)等生物信息大分子物質(zhì)，這一性質(zhì)與植物藥富含次生代謝產(chǎn)物有著很大的區(qū)別，也極大增加鑒定研究的難度，從總體上來說動物藥鑒定的研究相對薄弱但其對保證動物藥品質(zhì)量尤為重要[3]。本文將近些年來動物類中藥鑒定方法的內(nèi)容和應用做一簡要綜述，以期為動物類中藥的規(guī)范化質(zhì)量控制提供新的思路。

1 傳統(tǒng)鑒定方法

常見動物藥的傳統(tǒng)鑒定方法主要有性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定。傳統(tǒng)鑒定方法不依賴于現(xiàn)代化儀器設備，具有簡單快捷等諸多優(yōu)勢，尤其是具有豐富經(jīng)驗的老藥工們，能夠做到“辨狀論質(zhì)”，所以傳統(tǒng)鑒別方法依然是快速甄別藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣的有力手段，特別是在野外或缺乏儀器的實驗室貧困地區(qū)等[4]。

1.1 性狀鑒定 性狀鑒定是識別藥材最基本、運用最廣泛的方法，利用感官從動物藥的表面特征（形狀、顏色、紋路、突起、裂縫、附屬物等），到藥材斷面特征（顏色、紋理等）、質(zhì)地（光滑、粗糙、角質(zhì)性等），注意找出具有專屬性的性狀特征。其具有簡單明了的特點。目前大部分動物藥仍采用這種方法。譬如：海馬外形為“馬頭蛇尾瓦楞身”；羚羊角角彎中深銳緊小，有掛痕者為真，角內(nèi)有“骨塞”“通天眼”[5]；牛黃表面有“烏金衣”；蘄蛇有“翹鼻頭”“方勝紋”等特征[6]。近年來，隨著動物分類學和動物解剖學的發(fā)展，傳統(tǒng)性狀鑒別正在從經(jīng)驗化、通俗化向規(guī)范化、科學化方向發(fā)展[7]。

1.2 顯微鑒定 顯微鑒定是指用解剖學的方法在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、組織構(gòu)造、細胞內(nèi)含物等，在植物類藥材中應用較早且廣泛。由于動物藥材組成復雜，顯微鑒定的應用受到一定的影響和限制，起步較晚，發(fā)展較慢[8]。近年來，隨著顯微鑒定技術(shù)在動物藥鑒定中的發(fā)展，盡管動物類中藥沒有植物藥那么多的鑒別特征，但大部分動物類中藥也可通過顯微鑒定加以區(qū)別。

康廷國等[9]通過觀察動物藥殘留毛顯微特征，分析殘留毛一系列特征性參數(shù)，成功鑒別了狗鞭、驢鞭、牛鞭、貂鞭、干家雀五種動物藥材。苑冬敏等[10]利用蟬蛻、黑蚱、蟪蛄、焰螓蟬、金蟬衣的殘留毛顯微特征差異對蟬蛻的真?zhèn)芜M行了鑒別。邵燕等[11]對鼠婦蟲、蟲和蜣螂蟲的剛毛及體壁碎片特征進行了顯微鑒別，為鱉甲煎丸的質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

1.3 理化鑒定 理化鑒別是針對中藥所含主要化學成分或有效成分，采用物理或化學方法進行鑒別，一般用于性狀相似又無明顯顯微鑒別特征且化學成分不同的藥材[12]。一般的理化鑒定方法都適用于動物藥材，包括常規(guī)理化檢查、光譜法、色譜法。

1.3.1 常規(guī)理化檢查 蜂蜜的常規(guī)理化檢查中，可測定其相對密度；蜂蠟和蟲白蠟等可測定其熔點、溶解度或酸值、皂化值等物理常數(shù)，以控制其質(zhì)量[13]。劉惠娟等[14]發(fā)現(xiàn)，正品燕窩于365 nm燈下顯微藍白色，而燕窩絲、燕窩球等加工品多顯綠白色、藍紫色或灰綠色。顯微化學反應中燕窩的各種加工品及常見摻偽品對茚三酮、稀鹽酸、碘、溴、麝香草酚藍及堿性酒石酸銅的反應均與正品燕窩與之反應所得結(jié)果存在不同程度的差異。張貴均等[15]發(fā)現(xiàn)熊膽中的菜膽在紫外燈下呈現(xiàn)玻璃樣光澤的黃白色熒光，而金膽、人工引流熊膽皆呈淡金黃色熒光。魏越[16]基于透光率測定的梅花鹿茸結(jié)果表明透光率可作為梅花鹿茸各規(guī)格、等級飲片鑒別的依據(jù)。

1.3.2 光譜法 光譜法是一種較為先進的鑒定方法，主要是以其中藥成分中具有的“指紋”性特征為依據(jù)，對藥物進行鑒定[17]。光譜分析操作簡便、使用快捷、鑒定準確，對中藥材樣品的取量和破壞也相對較小，同時能夠最大化地重現(xiàn)藥材特性，提供更多的信息內(nèi)容，很大程度上彌補了傳統(tǒng)中藥鑒定的不足，逐漸成為主要的常用鑒定手段之一[18]。常見的鑒定動物類中藥的光譜法有紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光譜法以及X射線衍射法。

1.3.2.1 紫外光譜法 王喜軍等[19]利用紫外光譜獲得熊膽，豬膽，狗膽和羊膽汁的特征吸收，快速準確地對膽汁類藥材作出鑒別。董玉秀等[20]利用紫外光譜法鑒別了4個不同產(chǎn)地的10批鱉甲藥材，發(fā)現(xiàn)盡管吸收強度不同，但10批鱉甲在紫外區(qū)均有2個最大吸收峰，光譜鑒別法可作為本品的質(zhì)量控制指標之一。

紫外光譜的敏感度很高，對藥材的純度和雜質(zhì)鑒別效果顯著，但紫外光譜對相似度極高的中藥會出現(xiàn)吸收相似的現(xiàn)象使得鑒別不準確；而紅外光譜法制樣簡單，鑒別準確[21]。

1.3.2.2 紅外光譜法 Cho等[22]試驗證明，可以通過紅外光譜技術(shù)確定鹿茸的原產(chǎn)地，這為評估鹿茸質(zhì)量提供了依據(jù)。趙麗茹[23]通過紅外光譜分析技術(shù)，建立了哈蟆油的紅外特征光譜，為哈蟆油的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。冀憲領等[24]采用紅外光譜法得到僵蠶和健康蠶醇溶部位的紅外指紋圖譜，兩者指紋圖譜明顯不同；并且不同品種和季節(jié)的僵蠶紅外指紋圖譜也存在一定的差異。因此，用僵蠶醇溶部位的紅外指紋圖譜鑒別僵蠶，區(qū)別出不同品種和季節(jié)的僵蠶。

1.3.2.3 近紅外光譜法 近紅外光譜法是近年來發(fā)展較迅速的一種快速分析技術(shù)，有著光譜材料獲取速度快、樣品無需復雜預處理、對藥材破壞小且使用化學試劑少、操作簡便、成本低等優(yōu)點，在動物藥鑒定領域有著廣泛應用。

魏道智等[25]應用傅立葉變換近紅外光譜儀對螻蛄的不同種和異地的同一種以及混亂品種進行鑒別。結(jié)果表明近紅外分析法可應用于螻蛄種的分類以及螻蛄藥材的鑒定。楊文哲等[26]以《中國藥典》收載的5種海洋貝殼類中藥飲片為研究對象，采用近紅外光譜技術(shù)和主成分分析法研究該類飲片的鑒別。結(jié)果表明，該法能很好地區(qū)分牡蠣、石決明、珍珠母。

1.3.2.4 X射線衍射法 X射線衍射法是利用各藥材的相組成、成分各不相同，被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象，產(chǎn)生特有的衍射圖譜進而對中藥進行鑒定的方法[27]。

翁立明等[28]用X射線衍射Fourier圖譜分析技術(shù)對不同產(chǎn)地的10個全蝎樣品進行分析研究。結(jié)果表明，9個樣品衍射圖譜的幾何拓撲圖形基本一致，說明X射線衍射Fourier指紋圖譜鑒定法可用于動物中藥材全蝎樣品的分析鑒定和質(zhì)量控制。王樹春等[29]采用X衍射Fourier譜對4個花鹿茸樣品進行分析，它們的衍射圖形的幾何拓撲特征相同，可取它們共有的10個峰為花鹿茸的特征標記峰，以作為識別花鹿茸的依據(jù)。又用本法識別比較熊膽與偽品、天然熊膽與引流熊膽干燥品，結(jié)果引流熊膽與天然熊膽X射線衍射Fourier圖譜有一定的參考價值，且X射線衍射Fourier圖譜能識別熊膽偽品，是一種快速、簡便易行的物理鑒定方法，可作為熊膽質(zhì)量控制手段之一。

1.3.3 色譜法 色譜鑒定法包括薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。也可以幾種方法聯(lián)用技術(shù)對中藥進行鑒別[17]。

1.3.3.1 薄層色譜法 薄層色譜法（TLC）操作簡單、快速、經(jīng)濟、可靠，且可同時鑒別多個樣品，獨具特色。

張貴均等[15]應用新的展開劑對14種市售熊膽進行薄層鑒定，展開效果良好，可用于熊膽的真?zhèn)舞b別。張小蘭[30]通過薄層色譜法對哈蟆油樣品進行研究，建立了哈蟆油的TLC指紋圖譜，能夠有效地監(jiān)測哈蟆油的質(zhì)量，作為其質(zhì)量控制的手段，為名貴動物藥哈蟆油的開發(fā)和利用奠定了基礎。

1.3.3.2 氣相色譜法 氣相色譜法已廣泛應用于中藥材及中成藥揮發(fā)性成分分析，在動物類中藥的鑒定中也有一定的應用。

張皓冰[31]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，利用NIST標準譜庫檢索及結(jié)構(gòu)分析確定了19種甾體成分結(jié)構(gòu)，并提出了辨別麝香真?zhèn)蔚奶卣鞣椒āＭ跽谆萚32]利用氣相色譜分析測定藥材中斑蝥素成份，研究發(fā)現(xiàn)青娘子與斑蝥一樣含有斑蝥素但含量很低，而紅娘子不含斑蝥素。

1.3.3.3 液相色譜法 HPLC指紋圖譜儀器分析法具有很好的精密性、穩(wěn)定性及專屬性，應用廣泛。

黃玉明等[33]建立了蛤蟆油HPLC指紋圖譜，并對蛤蟆油真?zhèn)渭百|(zhì)量進行鑒定，結(jié)果可知這種方法可以有效檢測出蛤蟆油質(zhì)量，為蛤蟆油等動物類中藥的臨床應用、中藥科科研等提供有利條件，為蛤蟆油等動物類中藥的深入開發(fā)利用奠定基礎。丁興紅[34]運用HPLC測定了蘄蛇藥材中黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷和次黃嘌呤的含量，結(jié)果表明通過測定蘄蛇中尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和尿苷含量可以控制蘄蛇質(zhì)量。陳申如等[35]精確測定牡蠣提取物中的?；撬岷浚捎酶咝б合嗌V法測定牡蠣中?；撬岷?，該方法專屬性好，靈敏度高。

1.3.4 高效毛細管電泳法 高效毛細管電泳（HPCE）是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，具有高效、快速、樣本體積小和分析范圍廣闊等優(yōu)點。由于動物類藥材含有大量蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物，因此應用電泳技術(shù)對動物類藥材進行鑒定是行之有效的。

張朝暉等[36]對12種海馬、海龍類藥材采用HPCE進行鑒別研究，結(jié)果表明：該方法速度快、分辨力強、重現(xiàn)性好，為海龍、海馬類藥材的鑒別提供了一定的參考價值，也為動物類藥材的鑒別提供了新的分析手段。此后，陳振德等[37]應用HPCE對中藥穿山甲及其炮制品蛋白多肽進行分析，結(jié)果顯示穿山甲與穿山甲炮制品的酸性提取液HPCE圖譜有一定差異，可有效地加以區(qū)分。劉興國等[38]用HPCE對螞蝗及其混淆品菲牛蛭進行了鑒別，得出結(jié)論HPCE可快速準確地鑒別螞蝗和菲牛蛭。

由于動物藥化學成分的種類及含量高低與動物生境、采收季節(jié)、貯藏時間等諸多因素有關(guān)，故任何一種動物藥的理化鑒別均應把常用的理化方法結(jié)合起來進行綜合分析，進而篩選出具鑒別意義的有效參數(shù)，作為某種動物藥常用鑒定指標。

2 分子生物技術(shù)

近年來分子生物學技術(shù)在中藥質(zhì)量評價中的應用才剛剛開始，但其特有的優(yōu)點與好處迅速體現(xiàn)，分子生物鑒定方法鑒定能力較強，相比傳統(tǒng)中藥的鑒別方法，其準確性高、重現(xiàn)性好、真實、穩(wěn)定。在鑒定沒有背景信息的中藥樣品及在方法通用性和可數(shù)字化方面具有優(yōu)勢，應用前景廣闊。

DNA基因鑒定是近年動物類中藥鑒定中較為重要的分子生物技術(shù)，該技術(shù)從基因?qū)用嫔翔b別藥材，具有較高的準確性。DNA基因鑒定包括DNA分子遺傳標記，核酸探針雜交，DNA條形碼分子鑒定法等[4]。其中在動物類中藥鑒定中發(fā)展較快較好的為DNA分子遺傳標記和DNA條形碼分子鑒定法。

2.1 DNA分子遺傳標記 DNA分子遺傳標記技術(shù)（DNA molecular makers） 是DNA水平遺傳變異的直接反映。這種技術(shù)是一種以不同生物的個體遺傳物質(zhì)，即DNA的差異為根本來鑒別不同物種的方法。其原理在于生物的外觀性狀、組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、蛋白質(zhì)及化學成分除了受遺傳因素的影響外，還關(guān)系著生物的生長環(huán)境、生理狀態(tài)和發(fā)育階段等。但是DNA是遺傳信息直接載體，不會受到以上因素的影響，所以DNA分子的遺傳標記技術(shù)在對藥材鑒定方面有更高的可靠性和準確性[39]。

用于DNA分子遺傳標記的基因分為3種：一是葉綠體中的rbcL，matK，rpoC1，tmH-psdA等基因；二是核糖體中的18SrRNA，ITS1，ITS2等基因；三是線粒體中的Cytb，COI，12S rRNA，16S rRNA等基因。前兩者適合鑒定植物，后兩者則適用于動物鑒定[40]。

吳平[41]通過分析對烏龜、中華鱉和山瑞鱉線粒體12SrRNA基因片段序列來區(qū)分正品和混淆品。王義權(quán)等[42]擴增了烏梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，通過比較蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列，可以準確區(qū)分烏梢蛇及其混淆品。王建云等[43]以梅花鹿血、鹿鞭、鹿茸、毛為鑒定對象，采用微量DNA提取技術(shù)擴增DNA片段，擴增產(chǎn)物純化后用雙脫氧鏈終止法測定其序列，發(fā)現(xiàn)梅花鹿毛、血、鹿鞭的DNA序列完全一致，證明其來源都是梅花鹿，而鹿茸由于其來源不詳，與其他的梅花鹿DNA具有明顯的差異。

2.2 DNA條形碼分子鑒定法 DNA條形碼（DNA barcoding） 是由加拿大動物學家Hebert等[44]首次提出，是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的身份識別系統(tǒng)，它可以對物種進行快速的自動鑒定。DNA條形碼技術(shù)具有以下幾個顯著的特點：（1）直接利用DNA序列進行物種的鑒定，基于生物的基因型，具有獨一無二的可重復性，DNA序列在生物個體發(fā)育過程中不會改變，同種生物不同生長期的DNA序列信息是相同的，即使經(jīng)過加工，形態(tài)發(fā)生變化，而DNA序列信息不會改變，較之傳統(tǒng)的方法，擴大了檢測樣本的范圍，同時樣本部分受損也不會影響識別結(jié)果；（2）DNA條形碼序列具有通用性，只需一對或幾對通用引物，在不同物種之間具有可比性，可以形成統(tǒng)一的標準，適用于非專家物種鑒定。設計一套實驗流程，技術(shù)人員就可完成鑒定工作；（3）準確性高，鑒別速度快，特定的物種具有特定的DNA序列信息，而形態(tài)學鑒別特征會因趨同和變異導致物種的鑒別失誤，通過建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可一次性快速鑒定大量樣本[45]。DNA條形碼由于其基因序列較短、有充足的基因變化、測序較為簡單、鑒別度較高等優(yōu)點正在逐年增加其在中藥鑒定中的應用。特別是在名貴中藥材方面發(fā)揮著重要的作用，不僅可以鑒別其真?zhèn)?，亦能發(fā)現(xiàn)物種之間的生物親緣關(guān)系，從而獲得更加準確的物種分類信息。

王孟虎等[4]在《動物類中藥DNA條形碼鑒定研究進展》一文中指出DNA條形碼分子鑒定法是傳統(tǒng)鑒別方法的有效補充。由于不同物種的DNA序列是由腺嘌呤（A），鳥嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T） 4種堿基以不同順序排列組成，因此對某一特定DNA片段序列進行分析即能夠區(qū)分不同物種。崔麗娜等[46]對金錢白花蛇及其混偽品共4個種11份樣品的COI條形碼序列進行研究。最終由所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹可以看出，同屬聚在一起，且各物種又形成相對獨立的支，銀環(huán)蛇COI序列可明顯與混偽品區(qū)分開，為金錢白花蛇的鑒別提供了新的方法，在其他動物藥基源物種鑒定中也具有較大的應用價值。張紅印等[47]以COI作為條形碼序列，對蛤蚧實驗樣品進行DNA提取，PCR擴增和雙向測序，最終得出結(jié)論運用COI條形碼序列能夠準確鑒定蛤蚧及其混偽品，為保障蛤蚧藥材臨床用藥安全和市場監(jiān)管提供新的方法。張蓉等[48]采用線粒體COI基因，在靠近5'端設計了一對鹿類DNA條形碼通用引物，對來源于鹿科動物3個屬共計19份樣本的鹿茸進行PCR擴增和序列測定，發(fā)現(xiàn)除梅花鹿、馬鹿的個別樣本外DNA條形碼鑒別方法對90%的鹿茸樣本可進行有效地鑒定。

但由于該技術(shù)是通過基因進行鑒定，對實驗材料及提取方法有較高要求，對一些年代較久的動物藥材，其DNA降解較為嚴重，為DNA提取技術(shù)提出了較高的要求；該技術(shù)只能鑒別其來源是否準確卻不能鑒別其藥用部位是否準確，這就需要結(jié)合其他鑒別方法來準確鑒別其藥用部位[4]。

3 免疫鑒別法

免疫鑒別法是一種特異性很強的鑒別方法，以藥材中含有的特異蛋白為抗原，制備出特異的抗體，再與檢驗品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應，據(jù)此鑒別藥材的真?zhèn)巍６∨噘t等[49]利用虎、豹等骨骼中的特異抗原成分制備虎、豹骨等多種動物骨骼的抗體，還能將豹骨進一步鑒別為雪豹、云豹或金錢豹。

4 展望

傳統(tǒng)鑒定方法是在長期的實踐中總結(jié)和發(fā)展起來的，是前人智慧的結(jié)晶，在鑒定領域仍占據(jù)著重要的作用，是動物藥鑒定的基石。隨著技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)鑒定方法逐漸向數(shù)字化技術(shù)發(fā)展?，F(xiàn)代生物技術(shù)將成為動物研究鑒定的主潮流之一，我國的動物藥鑒定研究，應當積極吸納先進的科技手段，同時鞏固發(fā)展傳統(tǒng)鑒定方法，不斷發(fā)展自己，走綜合發(fā)展的道路，為動物類中藥正本清源，凈化動物藥中藥市場，促進中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的規(guī)范化、標準化和國際化的發(fā)展。