MLPA在產前診斷性染色體嵌合體的應用價值

梁福笑　謝潤桂　何曉旋等

[摘要]目的探究多重連接探針擴增技術（MLPA）在產前診斷性染色體嵌合體的價值。方法收集2015年6月～2016年6月東莞市婦幼保健院產前診斷中心經核型分析或MLPA P095非整倍體檢測試劑盒檢測發現的性染色體嵌合體病例作為研究對象，共11例。比較這兩種方法的檢測結果，并用熒光原位雜交（FISH）驗證性染色體嵌合體的真實性。結果MLPA結果顯示，11例標本中，有9例標本（病例9至病例17）MLPA與核型分析結果均是陽性，其中8例（病例9至病例16）兩種結果一致，1例（病例17）結果有差異。有1例（病例18）MLPA檢測結果為嵌合體，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析發現嵌合體，而MLPA檢測結果正常。FISH檢測：除病例16外，其余病例均為真性嵌合體。MLPA、核型分析診斷性染色體嵌合體的靈敏度為90%，符合率為81.82%。結論MLPA對于產前診斷陛染色體嵌合體具有重要意義。

[關鍵詞]多重連接探針擴增技術（MLPA）；核型分析；熒光原位雜交（FISH）；產前診斷；性染色體嵌合體

[中圖分類號]R714.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）18-101-03

當染色體嵌合體發生在性染色體上時，就稱之為性染色體嵌合體。性染色體嵌合體屬于染色體非整倍體異常中的一種，其中嵌合體可以是染色體數目的異常、染色體結構的異常或者是同時伴有染色體數目和結構的異常改變。這種染色體的異常變化會導致相應的患兒可能表現出生殖器模糊、性腺的發育不完善及患性腺腫瘤的危險性增加等，給患兒和其家庭帶來嚴重的經濟和精神壓力。因此，做好性染色體嵌合體的產前診斷就顯得尤為重要。目前常用的檢測方法是培養羊水細胞來做染色體核型分析，但此類方法耗時長，并且操作繁瑣，因此我們考慮應用MLPA P095非整倍體檢測試劑盒進行產前診斷，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2015年6月～2016年6月東莞市婦幼保健院產前診斷中心經核型分析或MLPA P095非整倍體檢測試劑盒檢測發現的性染色體嵌合體病例作為研究對象，共11例。其中孕婦的年齡為21～37歲，平均為（28.3±3.4）歲；孕周為1～30周，平均為（21.00±4.40）周。本研究已經我院倫理委員會批準，所有孕婦均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2檢測方法

DNA的提取：取羊水1.5mL左右，離心后棄上清，加入GB緩沖液、蛋白酶等，混合后培育十分鐘。加入無水乙醇，常溫下放3min后離心，將混合后獲得的液體移置吸附柱，離心后棄上清，再加入GD緩沖液、PW緩沖液等，離心后棄上清。離心，棄上清，在常溫下放置數分鐘。把CR2移置潔凈離心管，加入TB后在室內放置5min，離心。應用天根生化科技有限公司生產的微量樣品基因組DNA提取試劑盒（DP316）提取羊水或者臍帶血標本中基因組DNA。應用荷蘭MRC-Holland公司生產的SALSA MLPA P095 Kit染色體非整倍體檢測試劑盒來進行靶序列DNA雜交、連接及PCR擴增，形成PCR產物。將產物通過毛細管電泳分離得到數據，應用Genemapper4.02分析軟件對收集的數據進行分析最后得出結論。通過貼壁細胞培養法培養羊水細胞，制片，分析染色體核型來進行染色體核型分析的檢測。采用雅培公司生產的FISH探針來進行FISH檢測，經過探針標記、雜交、染色體顯帶、熒光顯微鏡檢測和結果分析而得出檢測結果。

1.3觀察指標

分別計算染色體核型分析和MLPA技術的診斷符合率和靈敏度。診斷符合率=真陽性+真陰性/總例數，診斷的靈敏度=真陽性/真陽性+假陰性。在兩個及其以上原位培養物中均最少出現兩種及其以上的異常染色體核型，異常核型均在兩個及兩個以上的細胞集落中出現，且核型相同，則可認為是真性嵌合體。

2結果

2.1三種檢測方法結果的比較

在11例性染色體嵌合體標本中，有9例標本（病例9至病例17）MLPA與核型分析結果均是陽性，其中8例（病例9至病例16）兩種結果一致，1例（病例17）結果有差異。此外，有1例（病例18）MLPA檢測結果為嵌合體，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析發現嵌合體，而MLPA檢測結果正常。FISH檢測顯示，結果不一致的3例病例（病例17、病例18和病例19）的未培養羊水細胞經X染色體探針熒光原位雜交技術分析，證實均為真性嵌合體，而結果一致的8例病例中，病例16的染色體核型正常，其余病例均為真性嵌合體。染色體核型分析、MLPA、Fish檢測的結果分別見表1～3。

2.2 MLPA和核型分析診斷性染色體嵌合體的符合率和靈敏度

MLPA診斷性染色體嵌合體的靈敏度為90%，符合率為81.82%。染色體核型分析診斷性染色體嵌合體的靈敏度也為90%，符合率為81.82%。

3討論

目前，產前診斷染色體異常的方法主要是染色體核型分析。這種檢測手段也具有一定的缺點，包括從采集標本到得出結果所需要的時間長、對技術人員的專業水平要求高、細胞培養的過程容易受到污染等。因此，臨床工作中迫切需要新的診斷技術來彌補染色體核型分析的缺陷。隨著分子生物學技術的發展，QF-PCR、MLPA等技術涌現出來，比較適合在臨床檢測中使用。

MLPA技術，也就是多重連接探針擴增技術，是近些年發展起來的可以針對被檢測DNA序列進行半定量和定性分析的一種技術，具有高效、特異、快速、成本低及簡便的優點。MLPA探針包括兩個熒光標記的寡核苷酸片段，而每個探針都包含一段引物和一段特異性序列。而兩個寡核苷酸片段可以與靶序列DNA進行雜交互補，經連接酶連接，PCR擴增，通過毛細管電泳分離擴增產物后分析整理數據而得出結果。這種方法同QF-PCR相比，消除了由于引物的類型不同而引起的擴增效率并不相同所造成的誤差，因此準確性更高。

在本研究中，11例標本中，有9例標本（病例9至病例17）MLPA與核型分析結果均是陽性，其中8例（病例9至病例16）兩種結果一致，1例（病例17）結果有差異。此外，有1例（病例18）MLPA檢測結果為嵌合體，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析發現嵌合體，而MLPA檢測結果正常。FISH檢測：除病例16外，其余病例均為真性嵌合體。MLPA、核型分析診斷性染色體嵌合體的靈敏度為90%，符合率為81.82%。我們可以發現，同染色體核型分析檢測的結果相比，MLPA技術與其在診斷性染色體嵌合體時具有相同的診斷符合率和靈敏度。這可能與MLPA技術通過探針的應用，可以將不同染色體所占數目的比例變為雜交探針數目的比例，并且通過PCR技術，將這種比例進行了數倍的放大，因此對于染色體異常的診斷準確性比較高有關。由于性染色體嵌合體的發病率較低，本研究中所選用的病例也較少，尤其是診斷結果為陰性的病例，因此并未給出相應特異度的相關計算。而且，MLPA的應用也具有一些限制性，包括并不能檢測染色體的平衡易位、檢測樣本易受污染等。

綜上所述，同染色體核型分析方法相比，MLPA技術對于產前性染色體嵌合體的診斷也具較高的診斷靈敏性和診斷符合率，值得在產前性染色體嵌合體的診斷中推廣應用。endprint