“生物農藥”來襲

何凱柯+王子璇+李潤龍

水稻紋枯病是南方水稻病害之首。目前以化學農藥為主的防治手段普遍存在抗藥性、農藥殘留等問題，嚴重影響了當地土壤微生物群落的多樣性，不利于農業的可持續發展。

湖南湘潭縣中路鋪鎮鳳形山屬丘陵地帶，四季分明，雨量豐沛，空氣質量好。我們從山坡土壤中分離鑒定了四株芽孢桿菌：短小芽孢桿菌ZN-2、海洋芽孢桿菌ZN-3、甲基營養型芽孢桿菌ZN-4、蠟樣芽孢桿菌ZN-6。

當地村民往往是一季水稻一季油菜輪種，可利用四株芽孢桿菌對水稻紋枯病和油菜菌核病做生防試驗，篩選對有機水稻進行生物防治高效、無副作用的有益微生物，為有機農產品生產和環境及食品安全奠定基礎。

一、鳳形山有益微生物對水稻紋枯病的抑菌活性

1.供試菌種

生防菌株：短小芽孢桿菌ZN-2、海洋芽孢桿菌ZN-3、甲基營養型芽孢桿菌ZN-4、蠟樣芽胞桿菌ZN-6。

致病真菌：水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌（立枯絲核菌）。

2.試驗步驟

將四種活化36h的生防菌分別接種到LB液體培養基中，在28 ℃、180r/min下搖培36h，至菌懸液終濃度達到1.0×109 CFU·mL-1，即為四種生防菌發酵液制劑。所得四種培養液分別在12 000rmp離心20min，取上清液進一步過濾獲得四種無菌提取液制劑。

將水稻紋枯病和油菜菌核病菌接種到PDA平板上，置于25℃培養箱中培養。將培養好的病原真菌菌碟0.5 mm置于平板中央，在與平板中央和平板邊緣等距離位置放置5mm直徑濾紙，承載菌懸液并防止其流散。然后在濾紙上滴加150μL制備好的生防菌懸液，以添加無菌水作為對照組。接種后的平板置于28 ℃培養箱中培養，當對照平板中菌絲長滿平板時測量抑菌圈直徑。

3.試驗結果

結果顯示，甲基營養型芽孢桿菌ZN-4對油菜菌核病菌有顯著的抑菌活性，ZN-2、ZN-3、ZN-6對油菜菌核病菌均無明顯的抑制效果。

而短小芽孢桿菌ZN-2對水稻紋枯病菌有顯著的抑制作用，ZN-3、ZN-4、ZN-6對水稻紋枯病菌均無明顯的抑制效果。

二、ZN-2與ZN-4混合無菌提取液對水稻紋枯病的抑制活性

1.制備防治制劑

將活化好的ZN-2與ZN-4接種于LB液體培養基中，在37℃下振蕩培養24h 至48h。待菌細胞濃度均達107cfu/mL以上，以等體積比例混合配成培養液，即為混合菌發酵液制劑。

所得培養液在12 000rmp離心20min，取上清液進一步用濾器過濾（濾膜孔徑為0.22um）獲得無菌提取液制劑。

2.混合菌發酵液制劑對水稻紋枯病的抗菌活性檢測

在PDA平板中間接入培養3天至5天的直徑為5mm植物病原真菌水稻紋枯病菌碟，28℃恒溫培養。36h后，將混合菌液分別接種在距離真菌菌落中央2cm處，使其成為菌落。繼續培養，定期檢查抑制效果。

3.無菌提取液制劑對水稻紋枯病的抗菌活性檢測

在PDA平板上對稱打4個直徑為5mm的孔洞，其中兩個孔滴入20uL混合菌過濾液，另外兩個孔滴入200uL無菌水作對照。在培養基上鋪一層無菌玻璃紙，以防止其揮發。在平板中央移入水稻紋枯病菌碟，28℃下培養，觀察有無抑菌圈產生。

4.不同濃度無菌提取液制劑對水稻紋枯病菌的影響

將混合菌無菌提取液二倍稀釋液按1%、2%、4%、8%、16%濃度混勻至溶化的PDA培養基中，制備平板，以加等體積的無菌水處理為對照，每種處理重復三次。晾干后在平板上鋪一層滅菌玻璃紙，并在平板中央接種5mm水稻紋枯病菌碟，25℃恒溫培養。待對照平板長滿菌絲后，測量菌落直徑，計算抑菌率。

試驗表明，無菌提取液對水稻紋枯病菌絲生長具有顯著的抑制作用。從菌落直徑來看，當添加濃度達到8%時，抑制率達到50%以上；當添加濃度為2%時，對病菌生長有一定的抑制作用，但已明顯下降。

三、總結

綜上所述，短小芽孢桿菌ZN-2及其與甲基營養型芽孢桿菌ZN-4的混合無菌提取液能有效防治有機水稻紋枯病，有作為生物農藥的良好潛力。但如何保證短小芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌及其混合無菌提取液在田間試驗中的穩定性，還需要進一步研究。（指導老師：蔣銀生段家鐵）endprint