改良熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA的條件優(yōu)化

楊昭　何春蘭　李芬芳

摘要：針對(duì)青香蕉果肉組織富含多糖、多酚類物質(zhì)的特點(diǎn)，采用改良熱硼酸法提取青香蕉果肉組織中的總RNA，探討提取緩沖液pH值、離子濃度、CaCl2濃度、處理溫度、處理時(shí)間、LiCl沉淀時(shí)間對(duì)總RNA提取質(zhì)量的影響，并用異丙醇簡(jiǎn)化LiCl沉淀總RNA過(guò)程。結(jié)果表明，獲得了1種快速提取青香蕉果肉組織中總RNA的方法，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）驗(yàn)證，該方法適用于黃香蕉果肉、黃香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中總RNA的提取。

關(guān)鍵詞：熱硼酸法；青香蕉；異丙醇沉淀；總RNA

中圖分類號(hào)： S668.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0049-05

香蕉是世界上貿(mào)易量很大的水果，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織定位為發(fā)展中國(guó)家的第4大糧食作物[1]，也是我國(guó)南方的五大名果之一，是國(guó)內(nèi)重要的消費(fèi)和出口資源。由于香蕉重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，各國(guó)科學(xué)家關(guān)于香蕉功能基因的研究成為一個(gè)熱點(diǎn)。特別是2012年法國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的國(guó)際小組對(duì)二倍體香蕉DH-Pahang基因組序列進(jìn)行了測(cè)定[2]，吸引了更多的研究人員關(guān)注香蕉功能基因的研究。香蕉組織總RNA的提純是進(jìn)行香蕉功能基因研究的必要前提，在進(jìn)行RNA分析、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、cDNA合成、Northern雜交、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、功能基因篩選過(guò)程中都需要有高質(zhì)量、高純度、完整性好的總RNA。

目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道香蕉組織總RNA的提取方法，這些方法主要是十二烷基硫酸鈉（SDS）法[3-8]、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[9-12]、TRIzol法[13]。這些報(bào)道僅研究單一提取方法或?qū)追N提取方法的提取效果進(jìn)行比較，并未對(duì)影響香蕉組織總RNA提取的關(guān)鍵因素進(jìn)行分析。一旦提取過(guò)程中出現(xiàn)RNA純度低、質(zhì)量差的情況則很難分析其原因。因此，有必要了解在提取過(guò)程中影響RNA質(zhì)量的詳細(xì)因素，以便有針對(duì)性地解決提取總RNA過(guò)程中的問(wèn)題。

筆者所在課題組在進(jìn)行香蕉多酚氧化酶基因克隆研究中，須從青香蕉果肉中提取總RNA用于研究。但是青香蕉果肉的硬度、果膠含量、多酚含量均高于成熟香蕉[14-15]，采用RNA提取試劑盒和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法，均不能獲得合格的RNA。香蕉組織細(xì)胞內(nèi)的多糖、多酚及色素等次生物質(zhì)，在RNA提取過(guò)程中很難去除干凈[16]。多糖等雜質(zhì)的存在不僅會(huì)使RNA的溶解度降低，還可以抑制許多工具酶的活性，且多酚、色素等物質(zhì)在提取過(guò)程中很容易被氧化而導(dǎo)致RNA變性，影響RNA用于進(jìn)一步的分子操作，因此，能否在提取過(guò)程中盡可能多地去除這些干擾物質(zhì)是獲得高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵[17-19]。

熱硼酸法提取植物組織總RNA已被多次改良，應(yīng)用于富含多酚的不同作物、組織總RNA的提取[20-21]。但是目前，未有關(guān)于熱硼酸法提取青香蕉果肉組織總RNA過(guò)程中影響其質(zhì)量的因素研究。在本研究中，筆者對(duì)熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA全過(guò)程中的各種影響因子進(jìn)行了分析，擬摸索出一種既快速又高效地提取青香蕉果肉總RNA的方法，以期為深入開(kāi)展香蕉功能基因的研究奠定良好的基礎(chǔ)，同時(shí)為其他富含多糖、多酚類植物的總RNA提取提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

巴西香蕉果實(shí)、花采摘于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站實(shí)驗(yàn)基地（福山實(shí)驗(yàn)基地）。將采收的香蕉花、青香蕉、黃香蕉的果肉、果皮分離后分別用液氮速凍，置于-70 ℃冰箱保存。

1.2試驗(yàn)儀器

SuperRT cDNA Kit（CW0741），北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；超微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000），美國(guó)Thermo公司；PCR儀（Tpersonal 48），德國(guó)Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)（G：BOX/EF2），美國(guó)Syngene公司；核酸電泳儀（DYCP-31F），北京市六一儀器廠。

1.3香蕉果肉總RNA提取條件優(yōu)化

1.3.1RNA常規(guī)提取方法參照Asif等的方法[12]進(jìn)行優(yōu)化。首先將玻璃器皿、鐵勺、研缽等清洗干凈，然后用錫箔紙包裹，于180 ℃烘烤8 h以上，離心管等塑料制品均用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）水浸泡過(guò)夜，并于121℃高壓滅菌 30 min，60 ℃烘干備用。具體操作如下：

（1）提取緩沖液[2% CTAB，100 mmol/L Tris-硼酸（pH值8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH值8.0），2% PVP-K30]用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%，將其預(yù)熱至60 ℃；（2）果肉用液氮速凍后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入1 mL提取緩沖液，渦旋混勻，于60 ℃放置30 min，每隔 5～10 min顛倒混勻1次；（3）將提取液冷卻至室溫，用等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫下于 12 000 r/min 離心5 min；（4）取上清液，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min 離心5 min；（5）在上清液中加10 mol/L LiCl至終濃度為 3 mol/L，-20 ℃放置4 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；（6）小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3 mol/L LiCl洗滌至少3次；（7）沉淀用0.3 mL DEPC處理水溶解，再用等體積的水飽和酚、三氯甲烷順序抽提；（8）吸取上清液，加入1/15體積的 3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5體積無(wú)水乙醇，冰上放置 0.5 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，沉淀多糖；（9）在上清液中加入1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍體積無(wú)水乙醇，于-70 ℃的冰箱沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗滌2次，0.5 mL無(wú)水乙醇洗滌1次，每次都于12 000 r/min離心1 min，室溫干燥后溶于RNase-free水中。endprint

1.3.2RNA提取條件優(yōu)化考察提取緩沖液pH值、離子濃度、CaCl2濃度、處理溫度、處理時(shí)間、LiCl沉淀時(shí)間對(duì)總RNA提取質(zhì)量的影響，并用異丙醇簡(jiǎn)化RNA沉淀過(guò)程。

1.3.3RNA質(zhì)量檢測(cè)RNA純度及含量檢測(cè)：取1 μL RNA溶液，通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)得到的RNA含量、D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值。純RNA D260 nm/280 nm值應(yīng)為1.8～2.2，D260 nm/230 nm值應(yīng)為2.0～2.4。RNA回收率計(jì)算：RNA回收率（μg/g）=（D260 nm×40×原液體積）/提取樣品質(zhì)量（g）。

RNA完整性檢測(cè)：用1.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。完整的RNA電泳結(jié)果應(yīng)是28S RNA與18S RNA亮度值比約為 2 ∶1，且這2條條帶之間、條帶上方和條帶下方幾乎沒(méi)有彌散現(xiàn)象。

1.3.4RT-PCR分析選用NCBI上登錄的香蕉MaActin1（GenBank登錄號(hào)：AF285176）片段為內(nèi)參，設(shè)計(jì)上、下游引物分別為MaActin1（5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′）、MaActin2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）[22]。RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的SuperRT cDNA第1鏈合成試劑盒。

PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×ES Master Mix，1 μL MaActin1（10 μmol/L），1 μL MaActin2（10 μmol/L），2 μL cDNA第1鏈，8.5 μL RNase-Free Water。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.5RNA提取方法驗(yàn)證將優(yōu)化的RNA提取方法應(yīng)用于香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮、黃香蕉果肉、黃香蕉果皮5種香蕉組織總RNA的提取，并進(jìn)行RT-PCR分析。

2結(jié)果與分析

2.1緩沖液pH值、離子濃度對(duì)RNA提取質(zhì)量的影響

針對(duì)香蕉組織富含酚類物質(zhì)的特點(diǎn)，采用硼酸緩沖體系的RNA提取液，有利于去除組織中的酚類物質(zhì)。其中的硼酸可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制酚類物質(zhì)的氧化及它們與RNA的結(jié)合[23]。由表1可見(jiàn)，Tris-硼酸緩沖液pH值對(duì)香蕉果肉RNA質(zhì)量、得率影響較大；Tris-硼酸緩沖液pH值為6、7、8、9時(shí)，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值，但RNA的得率差異較大；pH值為9時(shí)，得率最高，為18.14 μg/g。圖1顯示，Tris-硼酸緩沖液pH值為8、9時(shí)，28S RNA、18S RNA亮度比約為 2 ∶1，完整性較好。因此，選擇緩沖液最優(yōu)pH值為9。

由表2可見(jiàn)，Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100、200、300 mmol/L 時(shí)，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；Tris-硼酸緩沖液離子濃度為 100 mmol/L 時(shí)，得率最高，為26.97 μg/g。圖2顯示，Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100、200、300 mmol/L時(shí)，28S RNA、18S RNA 亮度比約為2 ∶1，完整性較好。因此，選擇Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100 mmol/L。

2.2CaCl2濃度、處理溫度、處理時(shí)間對(duì)RNA提取質(zhì)量的影響

鈣離子在RNA提取過(guò)程中可以有效去除組織中的高分子果膠[24]。由表3可見(jiàn)，CaCl2濃度為0、50、100、150、200 mmol/L 時(shí)，提取的香蕉果肉RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同CaCl2濃度所提取的RNA得率相差很小，當(dāng)濃度為 150 mmol/L，得率最大，為32.44 μg/g；當(dāng)不加CaCl2時(shí)，得率最低，為21.94 μg/g。圖3顯示，CaCl2濃度為0、100、200 mmol/L 時(shí)，28S RNA、18S RNA亮度比約為2 ∶1，完整性最好；CaCl2濃度為50、150 mol/L時(shí)，28S RNA ∶18S RNA小于 2 ∶1，完整性不好。綜合考慮，選取CaCl2濃度為 100 mmol/L。

由表4可見(jiàn)，CaCl2加入后放置在0、25、60 ℃，所提取RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同放置溫度所提取的RNA得率相差很大，當(dāng)放置在25 ℃時(shí)，得率最大，為20.57 μg/g。圖4顯示，CaCl2加入后放置在25、60 ℃，所提取RNA的28S RNA、18S RNA亮度比約為2 ∶1，完整性較好。所以，選擇CaCl2加入后的放置溫度為25 ℃。

3討論與結(jié)論

針對(duì)青香蕉果肉組織富含果膠、多酚等次生物質(zhì)，詳細(xì)考察各因素對(duì)總RNA提取質(zhì)量的影響，得出1種快速提取青香蕉果肉總RNA的方法，耗時(shí)約4 h，相比于傳統(tǒng)氯化鋰沉淀法（-20 ℃放置4 h或過(guò)夜放置），具有快速、操作簡(jiǎn)單、總RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，該方法可用于黃香蕉果肉、黃香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中總RNA的提取。從青香蕉果肉組織中提取的總RNA，可應(yīng)用于香蕉多酚氧化酶的基因克隆研究中，筆者所在課題組已成功獲得香蕉多酚氧化酶的基因[25]。

改良熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA的優(yōu)化提取方法：提取緩沖液內(nèi)含2% CTAB、100 mmol/L Tris-硼酸（pH值 9.0）、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH值8.0）、2% PVP-K30，用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%，將其預(yù)熱至60 ℃；組織用液氮速凍后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入 1 mL 提取緩沖液，渦旋混勻，于60 ℃放置30 min，每隔5～10 min 顛倒混勻1次；向提取混合液中添加0.5 mol/L CaCl2，使其濃度為100 mmol/L，25 ℃放置20 min；冷至室溫，用等體積的三氯甲烷、異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的三氯甲烷、異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min離心5 min；上清液加入等體積的異丙醇，-20 ℃沉淀20 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3mol/L LiCl洗滌至少3次；沉淀用0.3 mL DEPC水溶解，再用等體積的水飽和酚、三氯甲烷順序抽提；吸取上清液，加入1/15體積的3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5體積無(wú)水乙醇，冰上放置0.5 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min；在上清液中加1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍體積無(wú)水乙醇，在-70 ℃冰箱中沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗滌2次、0.5 mL無(wú)水乙醇洗滌1次，每次都于 12 000 r/min 離心1 min，室溫干燥后將沉淀溶于RNase-free水中。endprint

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