Ghrelin基因在藏豬胃底組織中的mRNA表達

任子利　高卓然　李瑜鑫

摘要：為分析Ghrelin基因在藏豬與長白豬胃底組織中mRNA的表達差異，運用實時熒光定量PCR技術，對Ghrelin基因在藏豬與長白豬胃底組織中mRNA的表達水平進行相對定量檢測分析。結果顯示，藏豬胃底組織中mRNA的表達量（0.495 8±0.023 1）顯著低于長白豬（0.741 7±0.026 6）。說明Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達可能是藏豬生長緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長速度的進一步研究奠定基礎。

關鍵詞：Ghrelin基因；藏豬；胃底組織；mRNA表達；PCR技術

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0046-03

藏豬主要生活在我國青藏高原海拔2 500～4 300 m的農區和半農半牧區，是中國特有的能適應高海拔地區的一個重要品種[1-2]，有“高原之珍”的美譽[3]。然而，與長白豬的日增質量達731 g相比，藏豬的生長速度比較緩慢，一般18～30月齡體質量才達50～60 kg，日增質量只有171 g，提高藏豬的生長速度已成為藏豬飼養中的一個關鍵問題。饑餓激素（Ghrelin）被稱為胃饑餓素、生長素或生長激素釋放肽，是一種由28個氨基酸組成的多肽，是生長激素促分泌素受體（GHS-R）的一種內源性配體，由日本的Kojima等于1999年從小鼠和人的胃組織中成功分離并鑒定[4]。Ghrelin及其受體在動物體內廣泛分布，具有調節生長激素分泌、攝食、能量代謝、生殖等多種生物學作用[5-6]。在豬、羊等動物上已證實，動物攝食可以促進動物生長[7-8]。模擬高原的低壓低氧環境可致大鼠血清Ghrelin水平下降，胃黏膜Ghrelin分泌減少，Ghrelin可能參與模擬低壓低氧環境中機體消化功能紊亂的調節[9]。然而，關于藏豬胃底組織中Ghrelin基因的mRNA表達水平是否與長白豬有差異，目前未見相關報道。因此，本研究運用實時熒光定量PCR技術，對Ghrelin基因在藏豬與長白豬胃底組織中mRNA的表達進行相對定量檢測分析，以探討藏豬生長緩慢的可能原因，為提高藏豬生長速度的進一步研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集及處理

選擇生長發育和營養狀況正常的6月齡藏豬與3月齡長白豬胃底組織樣本各12個（分別取自西藏大學農牧學院實習基地、西藏林芝當地屠宰場），取樣后將樣本迅速放入RNA樣品保存液中，迅速帶回實驗室進行總RNA的提取或放于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2主要試劑與儀器設備

Trizol（碧云天生物技術研究所），Quantscript RT Kit、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）（天根生物技術有限公司），2xPCRMix（北京百泰克生物技術有限公司）。

PCR儀（德國Eppendorf公司），Boi-Rad凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），CFX96突光定量實時PCR儀（美國Bio-Rad公司），NanoDrop ND-1000紫外分光光度計（美國NanoDrop公司），Eppendorf Centrifuge 5417R、5415R離心機（德國eppendorf公司）。

1.2引物設計與合成

根據GenBank中已公布的豬Ghrelin基因（目的基因）以及β-actin基因（持家基因）的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計定量引物，并送交生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2個基因的引物信息見表1。

1.3總RNA的提取與鑒定

利用Trizol一步法，按照該試劑說明書，提取各個樣本的總[CM（25]RNA。先用紫外分光光度計測總RNA濃度和純度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性，若RNA的純度和完整性均符合要求，立即進行反轉錄或置于-80 ℃條件下保存備用。

1.4反轉錄cDNA

按照Quantscript RT Kit試劑盒說明書提供的方法，將稀釋成同一濃度總RNA的各個樣品反轉成cDNA，接著進行后續試驗或置于-20 ℃條件下保存備用。

1.5基因的PCR擴增

用梯度PCR篩選2對引物的最佳退火溫度后，以cDNA第一鏈為模板，加入引物、dNTP和2xPCRMix等，混勻后進行PCR擴增。反應體系包括反轉錄產物（cDNA）1 μL、2xPCRMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，總體積20 μL。PCR擴增反應參數為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，36個循環；72 ℃延伸 5 min，4 ℃結束。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.6熒光定量PCR

目的基因及持家基因的熒光定量PCR的反應程序為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 10 s，65～95 ℃每增加0.5 ℃讀取熒光1次，繪制溶解曲線。熒光定量PCR反應采用20 μL反應體系：2X SYBR PCR Buffer 10 μL，cDNA 1 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。目的基因的相對表達量用2-ΔΔCT法計算。

1.7數據統計分析

所得試驗數據用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，試驗結果用“平均數±標準差”表示，P<0.05為差異顯著；用Sigmia Plot軟件作柱狀圖。

2結果與分析

2.1總RNA的檢測結果endprint

經紫外分光光度儀測定，各個樣本總RNA的純度（D260 nm/D230 nm）均為2.06～2.15，[JP2]瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，可見28S、18S、5S等3條條帶。這說明所提取的總RNA純度和完整性均符合反轉錄的要求，可以進行反轉錄試驗。

2.2基因的PCR擴增檢測結果

由圖2可以看出，目的基因與持家基因條帶均在恰當位置，后經測序證實這2條條帶即為目的基因與持家基因。

2.3實時熒光定量PCR檢測結果

藏豬、長白豬胃底組織目的基因Ghrelin及持家基因 β-actin cDNA擴增曲線、熔解峰如圖3所示，熔解曲線為單一的峰，說明沒有非特異擴增。

[FK（W13][TPRZL3.tif；S+2mm]

Ghrelin相對表達量如圖4所示，藏豬胃底組織中mRNA的表達量（0.495 8±0.023 1）顯著低于長白豬（0.741 7±0.026 6）。可見，Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達可能是藏豬生長緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長速度的進一步研究奠定基礎。

3結論與討論

Du等的研究結果表明，在仔豬斷奶后，其胃底Ghrelin mRNA表達量上調10 d[10]。在體外，半胱胺能顯著增加胃黏膜細胞Ghrelin mRNA的表達[11]。Yang等的研究表明，高銅日糧可以通過增強生長豬Ghrelin mRNA的表達水平、生長激素（growth hormone）的分泌來提高采食量、促進體質量的增加[12]；Yin等也有類似的結果，認為仔豬日糧中添加ZnO能刺激其胃中Ghrelin的分泌[13]。而禁食24、48 h均能顯著降低大鼠下丘腦中Ghrelin mRNA的表達水平[14]。在禁食72 h后，斷奶仔豬下丘腦、垂體、胃中Ghrelin mRNA的表達水平均

較低[15]。在豬、羊等動物上已證實，動物攝食可以促進動物生長[7-8]，本研究結果與之基本一致，即Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的表達顯著低于長白豬，這可能是藏豬生長緩慢的原因之一。然而李加龍卻得出相反的研究結果，在牦牛皺胃中，Ghrelin陽性細胞分布于黏膜層胃底腺的下部，而瘤胃、網胃和瓣胃上未見其表達，牦牛Ghrelin陽性產物的表達面積（S）和累計光密度值（IOD）均大于黃牛且差異極顯著（P<0.01），他認為牦牛胃中的Ghrelin可能以內源性為主，且與外源性相結合共同參與了食欲、攝食行為及能量代謝與平衡等生理功能的調節[16]。這可能與物種等不同有關，若究其原因，尚需進一步研究。

總之，Ghrelin具有調節生長激素分泌、攝食等多種生物學作用，而動物攝食可以促進動物生長。藏豬胃底組織中Ghrelin mRNA的表達量顯著低于長白豬，即該基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達可能是藏豬生長緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長速度的進一步研究奠定基礎。

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