不同哺乳動物密碼子偏性及聚類分析

楊佳棟　劉月琴　張英杰

摘要：為更好地認識哺乳動物GDF9基因在長期進化過程中為適應環境形成的密碼子使用模式，通過CodonW軟件計算不同哺乳動物GDF9基因的密碼子偏性指標，利用SPSS軟件對密碼子偏好性影響因素的相關性進行分析，結合密碼子偏性和最小進化法分析其親緣關系。GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為哺乳動物GDF9基因的最優密碼子，該基因偏愛使用以A或T結尾的密碼子；G、C含量和蛋白質親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素；聚類分析提示不同哺乳動物間的同源性越高，GDF9基因密碼子使用特征的相似性越高。

關鍵詞：哺乳動物；GDF9；堿基替換；密碼子偏性；聚類分析

中圖分類號： Q755文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0041-05

在雌性哺乳動物整個生殖周期過程中，卵母細胞只能來源于原始卵泡庫[1]。有研究表明，原始卵泡形成過程受激素、轉錄因子和相關通路的介導[2]。生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）作為轉化生長因子β超家族成員之一，在卵泡的發育過程中有關鍵的調節作用[3]。密碼子是DNA或RNA的堿基序列與其編碼蛋白序列之間的對應關系[4]。編碼相同氨基酸的密碼子為同義密碼子，在蛋白合成過程中，同義密碼子的使用頻率存在差異，且物種和基因對某一種或幾種密碼子的使用具有偏好性[5]。對基因密碼子偏好參數進行分析，能更好地理解和研究基因水平轉移和基因家族分化的發生[6]。因此對密碼子偏好性的研究可在分子的角度為GDF9基因序列特征、分類和遺傳進化規律提供重要信息。前人相關研究表明，GDF9基因具有刺激顆粒細胞減數分裂、抑制素的生成作用[7]，并影響卵泡發育和生殖功能[8]。Wang等發現通過siRNA敲除GDF9后能抑制倉鼠原始卵泡的形成，但添加GDF9純品培養卵巢會加速原始卵泡的形成[9]。在人、嚙齒類、牛、綿羊和有袋類動物卵巢卵母細胞中，GDF9基因特異性表達，但該基因在山羊卵母細胞和黃體中可同時表達[10-11]。GDF9基因還能通過多個信號通路促進顆粒細胞增殖過程[12]。馬會明等通過RNA干擾使該基因表達沉默，也能抑制顆粒細胞增殖過程[13]。這些研究通過探討不同哺乳動物已被克隆的GDF9基因，并在卵巢卵母細胞中進行了相關表達分析，但未開展密碼子使用偏性的研究，這不利于其異源表達和遺傳轉化等后續試驗的進行。GDF9基因密碼子使用偏好性的研究能為該基因的分類和進化提供重要信息。本研究利用CodonW軟件分析不同哺乳動物GDF9基因對密碼子的使用情況，基于GDF9基因最小進化法和同義密碼子相對使用度的歐式平方距離系數建立聚類關系，為GDF9基因功能的深入研究提供參考依據。

1材料與方法

1.1目的基因的來源

本研究所用基因資料都來源于Nucleotide（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）數據庫，12種物種包括靈長目蘇門答臘猩猩、普通狨猴和人，食肉目家貓和家犬，偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬，嚙齒目小家鼠和褐家鼠。各哺乳動物GDF9都是完整的cDNA序列（表1）。利用MEGA 6.0對上述核苷酸序列進行堿基分析。

1.2目的基因的篩選

對候選的哺乳動物GDF9基因cDNA序列進行如下規則的篩選：（1）cDNA序列為完整編碼蛋白序列；（2）該cDNA序列長度>300 bp；（3）蛋白翻譯部位位于細胞質；（4）質粒、轉座子及病毒上的基因不予考慮；（5）多拷貝基因不重復計算。

1.3相關密碼子偏性分析指標

通過CodonW軟件來分析GDF9基因密碼子使用偏性，分析數值包括有效密碼子數（effective number of codons，ENc）、密碼子偏愛指數（condon bias index，CBI）、同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）；同時通過該軟件來分析GDF9基因密碼子偏性的影響因素，即GC含量（GC）、密碼子第3位的GC含量（GC3s）、芳香族氨基酸比例（aromatic amino acid ratio）、蛋白質親水性（protein hydrophilicity）的相關性。

1.4堿基替代飽和度檢驗

利用BioEdit軟件對不同哺乳動物GDF9基因的cDNA序列進行比對，將比對結果保存為fasta格式，通過DAMBE軟件對比對結果的堿基替代飽和度進行檢驗，若轉換數和顛換數沒有達到飽和，可進行下一步的系統發育分析，反之亦然。

1.5系統發育樹的構建

通過CodonW軟件計算出不同哺乳動物GDF9基因的RSCU值，利用SPSS多元分析軟件計算其相應的歐氏平方距離，并進行系統聚類。通過MEGA軟件中最小進化法建立系統發育樹。

2結果與分析

2.1不同物種GDF9基因序列堿基特征

由表1可知，在12種物種中，靈長目蘇門答臘猩猩和人cDNA序列長度最短，但與普通狨猴差別較大，相差250 bp。偶蹄目家牛、牦牛和綿羊cDNA序列最長，但野豬cDNA序列短27 bp，這可能與單胃和反芻動物分類有關。在ATCG堿基分布中，除小家鼠（A+T=45.9%）、野豬（A+T=49.8%）和褐家鼠（A+T=47.2%）外，其余物種A+T堿基含量高于 G+C 堿基含量，表明GDF9基因更傾向于使用A或T堿基。

2.2密碼子使用偏性分析

ENc能反映密碼子使用頻率和同義密碼子平均使用頻率的偏差。ENc越小，偏好性越強，即高表達基因易于使用一種或幾種同義密碼子，反之亦然，即低表達基因所包含的稀有密碼子種類越多[14-15]。由表1可知，除家貓之外，其余11種哺乳動物的有效密碼子數均小于55，表明GDF9基因對同義密碼子使用存在一定的偏好性。但各哺乳動物的GC3s值與其G+C堿基含量有差異。當CBI>0時，即在0～1范圍之間；越接近0，表示該基因對密碼子使用為完全隨機，不存在偏性，反之亦然。本研究所用物種的密碼子偏愛指數均>0，其中家牛和牦牛的CBI值最小，均為0.024，小家鼠的CBI值最大，為0.107，但該值也遠離1，表明不同哺乳動物GDF9基因對密碼子的使用不存在絕對的偏好性。endprint

RSCU值的大小能反映同義密碼子家族的密碼子使用偏移情況，當RSCU=1時，表明密碼子使用沒有偏性；當 RSCU>1 時，表明此密碼子使用頻率較高[16]。由表2可知，RSCU>1.5的密碼子有25個，其中以GCT、TGT、TTT、GGG、ATT、CTG、CCT、CAG、AGA、AGG、ACT、ACC和CTG密碼子的使用頻率較高，同時可得出GDF9基因偏好使用A或T結尾的密碼子。

2.3密碼子使用偏性的影響因素分析

由表3可知，GC、GC3s和Aromo都與CBI呈正相關，其中GC與CBI呈顯著正相關，Gravy與CBI呈負相關；GC、GC3s和Gravy都與ENc呈負相關，其中Gravy與ENc呈顯著負相關，Aromo與ENc呈正相關。上述結果表明，GC含量和蛋白質親水性對GDF9基因密碼子偏性有影響。

2.4不同物種GDF9基因的堿基替代飽和度檢驗

圖1橫坐標代表核苷酸轉換數（s）和核苷酸顛換數（v），縱坐標代表基于F84模型建立的遺傳距離。GDF9基因的核苷酸轉換數和顛換數均隨著遺傳距離的增加而變大，且兩者呈線性增加關系，表明本研究所用的12種哺乳動物GDF9基因序列堿基替代未達到飽和，可進行下一步的聚類分析。

2.5GDF9基因的聚類分析

由圖2可知，12種哺乳動物共分為三大類：一類是偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬；一類是靈長目蘇門答臘猩猩、人、普通狨猴和食肉目家貓、家犬；另一類是嚙齒目小家鼠和褐家鼠，其中靈長目和食肉目的親緣關系較近，而偶蹄目、靈長目、食肉目與嚙齒目的親緣關系較遠，其中類間的最大距離標準化是25。由圖3可知，偶蹄目和食肉目親緣關系較近，二者與靈長目親緣關系較近，嚙齒目與其親緣關系最遠。2種不同方法構建的聚類結果不一致，但結合其密碼子偏性指標結果發現，親緣關系較近的物種，其密碼子使用偏好性一致。

3討論

密碼子偏好性的研究對了解物種起源于進化、目的基因的改造、 推測未知基因表達水平及預測目的基因最佳宿主奠定了理論基礎[17-18]，同時為轉基因研究中的甲基化能否引起基因表達量下降或基因沉默提供參考[19]。本研究所選12種哺乳動物GDF9基因的有效密碼子數值在49.57～53.42區間波動，密碼子使用上存在一定的偏好性；在堿基序列組成成分上，9種哺乳動物的AT含量高于GC含量，但密碼子第3位的GC含量（GC3s）與GC含量存在差異；12種哺乳動物有25個密碼子的同義密碼子相對使用度>1.5，其中以GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為主，說明GDF9基因偏好使用A或T結尾的密碼子。因此推斷堿基組成是造成密碼子偏好性的原因之一，這與姜艷等的研究結果[20]一致。

目前的研究認為，堿基差異（突變）、自然選擇、cDNA序列長度和tRNA豐度對密碼子偏好性均有影響[21]。Chen等發現自然選擇造成的密碼子變化可能提高基因表達效率和多肽折疊動力，但這只發生在特定的基因中，甚至在特定基因的特定位置中[22]。本研究選取不同哺乳動物相同基因，可忽略蛋白自然選擇和tRNA豐度等影響，通過分析密碼子使用偏性的影響因素，發現GC含量和蛋白質親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素。已有研究表明，GC含量對同義密碼子使用偏好性有重要影響，密碼子偏好性越強的基因越趨向于使用以G或C結尾的密碼子，且密碼子偏好性的變化往往由第3位密碼子決定[23]。因子在不存在自然選擇壓力的情況下，一定方向的突變壓力對第3位堿基種類會有影響[24]。

本研究基于密碼子使用偏性的聚類與基于最小進化法形成的聚類相比，發現同一目下的物種聚為一類，即親緣關系較近。但2種聚類結果存在差異，主要集中在前者將靈長目和食肉目聚為一類，后者將偶蹄目和食肉目聚為一類。這種聚類結果不一致的現象在植物和其他動物[25-28]中均出現過，提示我們在今后的研究中，對物種的分離不能僅局限于對堿基組成的分析。可結合密碼子使用偏性和編碼區序列總和的結果進行分析，這樣可為提高分類結果準確度提供重要參考。GDF9基因偏好使用的密碼子的確定有利于其轉基因表達系統的建立，并對其目的基因的改造和最優密碼子的優化等提供理論基礎。

4結論

本研究通過分析12種哺乳動物GDF9基因密碼子使用模式，發現不同哺乳動物間密碼子選擇偏性具有差異性，確定該基因的最優密碼子為GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT，且偏愛使用A或T結尾的密碼子。GC含量和蛋白質親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素。基于密碼子使用偏性的聚類與基于最小進化法形成的聚類均表明親緣關系相近的物種間的密碼子使用特征較為一致，但2種方法構建的聚類結果存在差異。

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