綠竹ISSR—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

徐雯　瞿印權　陳劍成

摘要：以綠竹基因組DNA為ISSR-PCR擴增模板，采用單因素試驗方法，對dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA設置7個不同濃度梯度進行研究，并對退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行篩選，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應體系和擴增程序，并利用優(yōu)化后的體系對100條ISSR引物進行篩選。最終確定的最佳反應體系為：20 μL的擴增體系中，dNTPs濃度為0.2 mol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1.0 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為2 μL、剩余體積用滅菌ddH2O補全。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復性30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)38次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以此體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復性好的引物。[JP2]本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應體系并篩選出高多態(tài)性引物，為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎。

關鍵詞：綠竹；ISSR；反應體系；擴增程序；引物篩選

中圖分類號： S795.501文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0034-05

綠竹[Dendrocalamopsis oldhami （Munro） Keng f.]是禾本科竹亞科（Bambusoideae）綠竹屬（Dendrocalamopsis）的模式種，是綠竹屬中分布最廣、栽培最多的竹種[1]。綠竹分布在中亞熱帶南部、南亞熱帶的北部和中部，主要分布于東南亞等國家[2]。綠竹原產(chǎn)我國臺灣省淡水，我國主要分布在浙江南部、福建、臺灣、廣東、廣西和海南等省區(qū)，是我國南方優(yōu)良速生的筍材兩用叢生竹種之一，具有較高的觀賞價值、經(jīng)濟價值和社會價值[3]。

分子標記技術經(jīng)過三代的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了十幾種分子標記技術，目前使用比較廣泛且成熟的技術有SSR、RAPD、ISSR、SRAP、RFLP、AFLP、SNP等[4-5]。ISSR技術是1994年Zietkiewicz等在SSR分子標記技術的基礎上發(fā)展起來的一種新的分子標記方法，它在SSR序列的3′或5′末端加上1～4個核苷酸作為反應的引物，從而擴大DNA序列[6]。此種分子標記技術具有簡單快捷易操作、DNA用量較少、穩(wěn)定性較好、試驗成本低等優(yōu)點，且擴增出的條帶多態(tài)性較好，重復性較高[7-8]。目前ISSR技術已經(jīng)廣泛應用于種質(zhì)資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、指紋圖譜的構(gòu)建等方面的研究，是目前使用最廣泛的分子標記技術之一[9-12]。本試驗采用了單因素多水平梯度方法建立綠竹ISSR-PCR最佳反應體系并篩選出高多態(tài)性引物，旨在為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試的材料取自于福建省東山國有赤山林場的綠竹地理種源試驗樣地。對不同的植株隨機選取3～5張新鮮葉片，將采集到的新鮮葉片用變色硅膠干燥的方法保存，將干燥的材料迅速帶回實驗室，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2DNA的提取與檢測

綠竹全基因組DNA的提取采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（Cat#BSC13S1）法，并對該種方法略作調(diào)整。提取完后用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性與清晰性，看是否有降解或斷裂現(xiàn)象，將滿足試驗條件的DNA稀釋到20 ng/μL，并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3引物篩選

本試驗ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學公布的100條引物序列，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，選擇1個DNA模板對引物進行初步篩選。從中選擇條帶清晰、重復性好、穩(wěn)定性較高、具有多態(tài)性的引物，最后確定初選引物為U815（圖1）。待最優(yōu)反應體系建立后，再進行復篩，從100條引物中最終篩選出14條最適宜的引物。

[FK（W13][TPXW11.tif；S+2mm][FK）]

1.4初始PCR擴增程序及反應體系

參照文獻[13-15]并作適當調(diào)整，確定初始擴增反應體系為：20 μL的擴增體系中，dNTPs濃度為 0.25 mmol/L，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，引物濃度為 0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1 U，DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為 2 μL，剩余體積用滅菌ddH2O補齊。初始擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5擴增程序的優(yōu)化

本試驗采用單因多水平梯度試驗法對影響PCR反應的dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA含量、退火溫度及循環(huán)次數(shù)7個主要因素進行篩選。其中dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度和模板DNA含量這5個因素設置7個梯度濃度水平（表1）。待最優(yōu)反應體系建立后，再篩選最佳退火溫度與最佳循環(huán)次數(shù)。使用預試驗中擴增效果較好的引物U815對綠竹的基因組DNA進行ISSR擴增，PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳45 min，電壓設為5 V/cm。并用紫外凝膠成像分析儀進行觀察和拍照。

1.6ISSR有效引物的篩選

以優(yōu)化的反應體系及擴增程序體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復性好的引物。endprint

2結(jié)果與分析

2.1dNTPs對ISSR-PCR擴增的影響

對dNTPs設置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L 7個不同濃度梯度，分別進行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。當dNTPs濃度為0.05 mmol/L時，PCR產(chǎn)率很低，高分子量區(qū)域條帶很少，整體條帶都比較暗，當dNTPs濃度為0.35 mmol/L時，擴增出的條帶也較暗，當dNTPs濃度為0.20～0.30 mmol/L時，條帶明亮而清晰，擴增效果較好。為降低試驗成本，最終選擇dNTPs濃度為0.20 mmol/L。

2.2Mg2+對ISSR-PCR擴增的影響[JP2]

不同濃度的Mg2+對綠竹ISSR-PCR擴增的影響顯著（圖3），過高過低都會影響擴增的結(jié)果。當Mg2+濃度低于或等于1.0 mmol/L時，高分子量區(qū)域沒有條帶，擴增出的條帶很暗，[JP2]當Mg2+濃度高于或等于2.5 mmol/L時，擴增出的條帶又會出現(xiàn)彌散的現(xiàn)象，當Mg2+的濃度為2.0 mmol/L時，擴增出的條帶比較清晰、穩(wěn)定。所以Mg2+最佳用量確定為2.0 mmol/L。

2.3Taq DNA聚合酶對ISSR-PCR擴增的影響

對Taq DNA聚合酶進行單因子篩選的結(jié)果如圖4所示，當Taq DNA聚合酶用量為0.50 U時，擴增出的條帶較弱，當Taq DNA聚合酶用量為1.00 U時，擴增出的條帶比較清晰。當Taq DNA聚合酶用量高于1.00 U時，低分子量區(qū)域出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，不易區(qū)分，當濃度過高時還易出現(xiàn)非特異性擴增。所以確定Taq DNA聚合酶最佳用量為1.00 U。

2.4引物濃度對ISSR-PCR擴增的影響

由圖5可知，當引物濃度在0.2～0.4 mmol/L時，擴增條帶較多，而且清晰且穩(wěn)定；當引物濃度高于0.4 mmol/L時，高分子量區(qū)域擴增出來的條帶較暗，低分子量區(qū)域擴增條帶不穩(wěn)定，還出現(xiàn)非特異性擴增；當引物濃度低于0.2 mmol/L時，低分子量區(qū)域擴增條帶數(shù)較少，且整體條帶比較暗。最后確定引物最佳用量為0.4 mmol/L。

2.5模板DNA濃度對ISSR-PCR擴增的影響

對模板DNA用量在10～100 ng之間設置了7個梯度水平進行PCR擴增，結(jié)果如圖6所示，7個梯度均能擴增出明亮的條帶，且擴增出的條帶數(shù)和清晰度差不多，說明模板DNA濃度對ISSR-PCR擴增的影響較小。在7個梯度中，模板DNA含量為50 ng時效果最佳，確定其為最佳濃度。

2.6退火溫度對ISSR-PCR擴增的影響

根據(jù)引物U815的Tm值52.9 ℃，在45～60 ℃之間設置了12個溫度梯度，結(jié)果（圖7）顯示，退火溫度對擴增影響明顯，當退火溫度較低時，擴增特異性較差，條帶較弱且比較模糊，當退火溫度升高時，電泳條帶逐漸增多，清晰度也逐漸增強，當退火溫度為47.5 ℃時，擴增的條帶數(shù)最為清晰穩(wěn)定，當退火溫度大于47.5 ℃時，高分子量區(qū)域和中等分子量區(qū)域條帶的擴增效率下降，直至無擴增條帶，且在低分子量區(qū)域也逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，整體電泳條帶數(shù)逐漸減少，清晰度也逐漸減弱，因此，確定引物U815的最佳退火溫度為47.5 ℃。

2.7循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴增的影響

PCR的循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴增也有一定的影響。本試驗對循環(huán)次數(shù)設置了30、32、35、38、40次5個梯度，試驗結(jié)果如圖8所示。當循環(huán)次數(shù)為38次時，擴增條帶最為清晰明亮其穩(wěn)定。所以選擇38次循環(huán)為ISSR-PCR反應的最佳循環(huán)次數(shù)。

2.8ISSR有效引物的篩選

根據(jù)綠竹優(yōu)化后的最佳反應體系，對100條引物進行擴增。部分引物篩選結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示，利用建立的體系篩選不同的引物時，大部分引物都能擴增出清晰、明亮的條帶，只有少部分引物擴增出的條帶數(shù)較少或不能擴增出條帶。說明本試驗建立的綠竹的最佳反應體系具有較高的重復性和穩(wěn)定性。最終在100條引物中篩選出14條擴增條帶清晰不拖尾，穩(wěn)定性較好的引物，分別為UBC807、UBC810、UBC811、UBC815、UBC822、UBC841、UBC856、UBC857、UBC858、UBC859、UBC868、UBC881、UBC895、UBC899。

3討論與結(jié)論

3.1討論

dNTPs作為PCR擴增的底物，對ISSR-PCR擴增的影響較大，由圖1可知，當dNTPs濃度很低時，DNA的合成速率很低，使得PCR產(chǎn)物單鏈化，擴增出的條帶較暗且產(chǎn)量較少；當dNTPs濃度較高時，dNTPs容易與Mg2+相鰲合，使得游離的Mg2+濃度降低，從而影響Taq DNA聚合酶的活性，同時還有可[CM（25]能導致堿基的錯誤滲入，使得擴增出的產(chǎn)物特異性下降[16-17]。所以正確地選擇好dNTPs的濃度非常重要。

Mg2+濃度對ISSR-PCR 擴增的影響非常顯著，Mg2+濃度變化直接影響Taq DNA聚合酶的活性，并間接影響引物與模板DNA的雙聯(lián)雜交體的解鏈溫度、引物的退火溫度、擴增產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的生成[17-18]。當引物濃度很低時，引物與模板DNA特異性結(jié)合不夠，擴增效率較低；而當引物濃度較高時，會增加引物與模板DNA非特異性結(jié)合，以及引物二聚體的生成，從而導致擴增效率的下降。本試驗設置的7個梯度差異顯著，說明Mg2+濃度對SSR-PCR 擴增的影響較大。

Taq DNA聚合酶直接影響ISSR-PCR擴增的成敗，Taq DNA聚合酶的用量受到反應體系以及酶的活性等因素的影響[18-19]；當Taq DNA聚合酶的濃度較低時，擴增效率較低，條帶較弱，當Taq DNA聚合酶的濃度較高時，會產(chǎn)生非特異性條帶。所以正確地把握好Taq DNA聚合酶的用量很關鍵[20]。endprint

引物濃度的高低會影響PCR擴增產(chǎn)物產(chǎn)量的多少。當引物的濃度過低時，擴增產(chǎn)物量很低，當引物的濃度過高時，又會形成引物二聚體和非特異性擴增，此二者也是PCR擴增的底物，它們會和靶序列競爭dNTPs和Taq DNA聚合酶，從而導致擴增效率的下降[19，21]。

模板DNA濃度對ISSR-PCR擴增也有一定的影響，當模板DNA的濃度過低時，模板DNA和引物的結(jié)合率就很低，導致擴增產(chǎn)物較少；當模板DNA的濃度過高時，會導致擴增條帶產(chǎn)生彌散現(xiàn)象，也會增加非特異性擴增。本試驗中模板DNA用量從10～100 ng設置了7個梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個梯度的條帶數(shù)和亮度很相似，并無明顯差別。說明適宜的模板DNA濃度范圍很寬，正常情況下對ISSR-PCR擴增的影響不大，這與其他學者的研究結(jié)果[22-26]一致。

退火溫度對ISSR-PCR擴增的影響也較大，當退火溫度較高時，會使得模板DNA與引物的親和度下降甚至不能結(jié)合，從而使得擴增的條帶數(shù)較少且較模糊；當退火溫度較低時，會導致模板DNA與引物的非特異性結(jié)合[27]。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著退火溫度的增加，擴增出的產(chǎn)物特異性越好，如果擴增結(jié)果相似，盡量選擇其中溫度較高的，一般最佳的退火溫度低于引物的真實Tm值5 ℃左右[28]。本試驗中篩選的最佳退火溫度為47.5 ℃，引物815的真實Tm值為 52.9 ℃，兩者相差5.4 ℃，在理論范圍內(nèi)。

循環(huán)次數(shù)也會影響ISSR-PCR擴增，當循環(huán)次數(shù)較少時，擴增的條帶數(shù)較少，且清晰度較低；當循環(huán)次數(shù)過多時，又會增加非特異性擴增。本試驗中當循環(huán)次數(shù)為38次時，擴增產(chǎn)量較多，條帶清晰，且穩(wěn)定性較好。

3.2結(jié)論

最終確定的綠竹ISSR-PCR最佳反應體系為：20 μL的擴增體系中，dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1.0 U，引物濃度為 0.4 μmol/L，模板DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為2 μL，剩余體積用滅菌ddH2O補全。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復性30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)38次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以此體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復性好的引物。本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應體系并篩選出高多態(tài)性引物，為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎。

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