水通道蛋白1，3在變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達及促鼻內(nèi)腺體分泌的研究

許敏達

變應(yīng)性鼻炎是一種常見的耳鼻喉科疾病，其發(fā)病率高達30%[1-2],臨床表現(xiàn)為噴嚏、鼻溢、鼻癢等癥狀。目前臨床藥物治療效果欠佳，考慮可能與變應(yīng)性鼻炎發(fā)生機制尚未闡明有關(guān)[3]。有研究表明，水通道蛋白(AQP)在維持機體液體轉(zhuǎn)運平衡中起著極其重要的作用，而變應(yīng)性鼻炎的高分泌性可能與AQP的表達異常有關(guān)[4-5]。本研究探討AQP與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系，并分析其在變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達情況及對腺體分泌的影響，旨在為變應(yīng)性鼻炎的治療提供實驗依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康清潔級健康大鼠40只購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，雌雄不拘，體重為200～300 g，將大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組20只，動物的飼養(yǎng)過程均符合西安市實驗動物管理規(guī)定。

1.2實驗試劑及儀器 卵白蛋白(OVA)購自美國Sigma公司；AQP1,3抗體購自美國PE公司；SP免疫組化試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；RM2145型切片機購自德國LEICA公司，奧林巴斯生物顯微鏡購自上海光學(xué)儀器五廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海姚氏儀器設(shè)備廠；HH-600-數(shù)顯三用恒溫水箱購自江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備:根據(jù)許海波[6]和李欽等[7]的方法進行造模。實驗組以O(shè)VA經(jīng)全身致敏并進行強化致敏，每天以1 mg/ml OVA滴鼻，對其進行激發(fā)，直至建立大鼠變應(yīng)性鼻炎動物模型。具體操作步驟：將大鼠分組后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。首先全身致敏：采用10%水合氯醛3 ml/kg對大鼠進行麻醉，并于大鼠左右前肢和后肢跖部皮下各一點注射0.2 ml和0.3 ml的抗原佐劑混懸液[每毫升含1 mg OVA，2 mg Al(OH)3]進行致敏。初次致敏5 d后開始強化致敏，在大鼠背部皮下10處注射0.5 mg OVA(溶于1 ml生理鹽水)；自初次致敏后第7天起每天用1 mg/ml OVA滴鼻1次(含有OVA溶液均以生理鹽水配制)，每次20 μl，并觀察滴鼻后大鼠打噴嚏、搔鼻的次數(shù)及鼻塞情況，每次觀察30 min，并記錄。模型建立后沿中線打開鼻腔后，以小棉棒輕輕擦取鼻腔黏膜表面的黏液，做涂片后行免疫組化染色。

1.3.2模型制備成功標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)觀察3～4周，并進行疊加積分評價動物模型，當(dāng)積分>5分時表示成功造模[6]。對搔鼻和噴嚏次數(shù)分別進行統(tǒng)計并計分。0分:鼻塞正常,吸氣明顯，鼻翼扇動；1分:鼻塞,濕啰音可聽到，且吸氣明顯，鼻翼扇動；2分:鼻塞，濕啰音明顯，吸氣明顯，鼻翼扇動；3分：鼻塞，濕啰音明顯，且出現(xiàn)次數(shù)較多≥2次。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血清學(xué)檢測：血清中Ca2+、K+、Na+和Cl-濃度應(yīng)用間接電極的方法進行檢測。

1.4.2免疫組化染色：AQP1,3的檢測應(yīng)嚴(yán)格按試劑盒說明操作(兔抗大鼠多克隆抗體)，實驗中AQP的陽性對照用豚鼠腎臟做對比，陽性是腎小管上皮細(xì)胞胞漿中染色為褐色。本實驗利用PBS來代替一抗作為陰性對照，采用Image-Pro Plus 6軟件計算平均光密度值，計算表達面積的比值。

1.4.3鼻內(nèi)腺體分泌率檢測：大鼠麻醉后，在20℃下，用棉線著染段置于一側(cè)鼻中段前下方黏膜處，靜止不動，5 min后取下棉線，立即測量棉線熒光素染色長度，棉線吸收率為0.054 μl/min，測得熒光棉線染色長度(mm)乘以吸收率為鼻內(nèi)腺體分泌量。

2 結(jié)果

2.1血清離子濃度 實驗組血清Ca2+和K+濃度較對照組降低，Na+濃度較對照組升高(P<0.01)；兩組血清Cl-濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2AQP1，3表達情況 兩組大鼠AQP1，3在鼻黏膜中表達不等，見圖1。對照組AQP1.3表達面積為(14.84±1.56)%，實驗組為(21.32±2.43)%。實驗組AQP1,3表達面積較對照組增加(P<0.05)。

表1 兩組大鼠血清離子濃度比較

注：對照組為正常大鼠，實驗組為變應(yīng)性鼻炎模型；與對照組比較，bP<0.01

圖1兩組大鼠鼻黏膜水通道蛋白1,3表達情況(SP×200)

A.對照組；B.實驗組

2.3鼻內(nèi)腺體分泌情況 對照組鼻內(nèi)腺體分泌量為(0.58±0.07)μl/min，實驗組為(2.07±0.36)μl/min。實驗組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對照組(P<0.05)。

3 討論

變應(yīng)性鼻炎模型的建立基本上都分為致敏階段和激發(fā)階段，但是對于模型建立過程中的細(xì)節(jié)，不同的研究單位和實驗室有著不同的建模方案，本實驗以O(shè)VA經(jīng)全身致敏，強化致敏后，以1 mg/ml OVA每天滴鼻，進行激發(fā)，直至建立大鼠變應(yīng)性鼻炎動物模型。

鼻黏膜受體可以與醛固酮發(fā)生結(jié)合作用，這種結(jié)合作用有效地降低內(nèi)淋巴液中K+濃度,增加Na+濃度，以及由此通過K+濃度改變內(nèi)、外淋巴液滲透壓[7]。因此醛固酮的增加可上調(diào)大鼠鼻黏膜AQP1,3的表達水平，并與其結(jié)合，AQP1,3表達的增加可能會直接改變水在鼻內(nèi)的分布狀態(tài)，誘導(dǎo)水代謝失調(diào)，進而發(fā)生變應(yīng)性鼻炎。本研究結(jié)果顯示，實驗組血清Ca2+和K+濃度低于對照組，Na+濃度高于對照組，提示變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生和AQP1,3的表達增加可能與機體醛固酮水平改變有關(guān)。

AQP1,3在不同組織表達部位的水平不同。有研究報道，AQP1,3在眼部的表達豐富：睫狀體非色素上皮、小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、晶狀體均有表達[8]。Stamer等[9]研究顯示，AQP1,3可能參與眼房水形成，青光眼的發(fā)病可能與其表達失衡有關(guān)。AQP1,3也表達于腦脈絡(luò)膜上皮微絨毛細(xì)胞頂質(zhì)膜，參與了水液由血液進入腦脊液的主動轉(zhuǎn)運過程，而且對大腦急性損傷時導(dǎo)致腦水腫的形成有重要作用[10]。AQP1,3在大鼠和人近端小管和髓袢降支上皮細(xì)胞的頂端和基底外側(cè)膜均有表達[11-12]，并參與腎臟水液的重吸收，以及對滲透梯度的形成有重要作用。然而，AQP1,3并未在大鼠鼻咽或鼻甲表層上皮檢測到，但在鼻咽上皮下毛細(xì)血管和小靜脈及鼻甲中毛細(xì)血管和靜脈竇表達水平較高[13]。AQP1,3在肝膽管內(nèi)皮細(xì)胞基底外側(cè)膜上及尿路上皮、鼻息肉中也有表達。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1,3在鼻黏膜上皮下成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血竇內(nèi)皮細(xì)胞表達豐富；而在上皮細(xì)胞層、黏膜內(nèi)腺體及導(dǎo)管均未見AQP1,3抗體標(biāo)記，且實驗組AQP1,3表達水平高于對照組。提示AQP1,3的增加可能會誘導(dǎo)了內(nèi)淋巴的生成增多，導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。 與江一鳴等[13]研究結(jié)果一致。

變應(yīng)性鼻炎時，經(jīng)變應(yīng)原激發(fā)毛細(xì)血管通透性增加，腺體分泌增強是大量鼻涕產(chǎn)生的主要液體來源。本研究結(jié)果顯示，實驗組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對照組。提示AQP1,3的增加可能會誘導(dǎo)鼻內(nèi)腺體活性增強，使其腺體分泌增加。 依據(jù)AQPs分布部位，AQP1,3表達增強，有利于上皮下組織液通過上皮層細(xì)胞，以及利于液體經(jīng)腺細(xì)胞轉(zhuǎn)運至腺管，促進大量鼻涕的產(chǎn)生，提示膜迷路積水的發(fā)生可能是由于AQP1,3表達增加誘導(dǎo)了內(nèi)淋巴產(chǎn)生增多導(dǎo)致的，但其發(fā)病機制仍需要進一步探明。

[1] 林煜芬,鐘澤斌,蘇燕娜.熱敏灸治療變應(yīng)性鼻炎36例臨床觀察[J].中醫(yī)雜志,2017,58(3):233-236.

[2] 陶嘉磊,汪受傳,姜茗宸,等.消風(fēng)宣竅湯對小鼠變應(yīng)性鼻炎模型效應(yīng)機制研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2017,33(2):212-216.

[3] 劉惠珍,鄭佩吟,向麗.天灸治療變應(yīng)性鼻炎的臨床效果及安全性分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2017,24(18):103-105.

[4] 趙梅珍,耿曉瑞,胡田勇,等.變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜水通道蛋白5的表達[J].南昌大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2015，55(1):11-14.

[5] 黎橋,席克虎,桂巖,等.18β-甘草次酸對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜中水通道蛋白1和5表達的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,44(11):961-965.

[6] 許海波.水通道蛋白1、4、5在實驗性變應(yīng)性鼻炎鼻粘膜中的表達和意義[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué),2007.

[7] 李欽,李玉芬,陳彥林,等.白細(xì)胞介素5和13受體對變應(yīng)性鼻炎大鼠血管細(xì)胞黏附分子1及γ干擾素的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2012,47(8):638-641.

[8] Patil R V, Saito I, Yang X,etal. Expression of aquaporins in the rat ocular tissue[J].Exp Eye Res, 1997,64(2):203-209.

[9] Stamer W D, Peppel K, O'Donnell M E,etal. Expression of aquaporin-1 in human trabecular meshwork cells: role in resting cell volume[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42(8):1803-1811.

[10] 張小娟，曹楠玨，強薇,等.水通道蛋白1和4在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進展[J].國際眼科雜志，2017，17(6)：1077-1081.

[11] 薄雙玲，田鶴，閻麗菁，等.水通道蛋白-1在小鼠腎小管發(fā)育中的表達[J].西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，37(1)：59-62.

[12] 王昱，張清，陳凱，等.原發(fā)性腎病綜合征患者尿水通道蛋白異常及其意義[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(12)：1055-1058.

[13] 江一鳴，李吉平，王家東，等.鼻黏膜上皮通道蛋白的研究進展[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24(2)：92-96.