轉染HBx改變Notch信號誘導肝癌HepG2細胞株多藥耐藥性研究

徐桐紅，于冬艷，任 玲

肝癌多藥耐藥(MDR)是影響化療效果及導致死亡的主要原因[1-2]。肝癌對化療藥物相對不敏感，對MDR發生機制不清楚。HBx具有多種調控功能，可激活腫瘤侵襲相關原癌基因和轉錄因子，是肝癌發病獨立危險因素[3-5]。Notch信號通路是高度保守的細胞間信號轉導通路。研究表明，Notch信號通路不僅對胚胎期腎臟發育起至關重要的作用，且參與多種腫瘤的發生和發展[6]，其能通過血管內皮生長因子促進腫瘤血管發生，從而促進腫瘤細胞增殖[7]。多藥耐藥蛋白(MRP)過表達是肝癌產生MDR的重要機制[8-9]。本研究采用基因轉染將HBx基因轉入肝癌HepG2細胞中，觀察HBx對HepG2細胞中Notch信號通路和MRP表達的影響，并探討轉染HBx對肝癌細胞增殖和MDR的影響及其可能的作用機制，為肝癌的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞株 人肝癌HepG2細胞株購自中科院上海生命科學院細胞庫，本所傳代保存，置于37℃、CO2體積分數為5%、含10%胎牛血清RPMI-1640培養基(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)的恒溫培養箱內培養。

1.2試劑 DMEM高糖細胞培養液(美國Gibco公司，批號：12100046)，DMEMF12(美國Gibco公司，批號：12400024)，HBSS緩沖液(上海研卉生物技術有限公司，批號：BS0101)，Trizol裂解液(美國賽默飛世爾科技，批號：15596026)，Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒(美國賽默飛世爾科技，批號：4366596)，Lipofectamine 2000轉染試劑盒(美國賽默飛世爾科技，批號：722255)，Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海前塵生物科技有限公司，批號：40302ES20)，B27補充劑(美國GIBCO，批號：17504-044)，CCK-8試劑盒(上海鈺博，批號：YB1198)，小牛血清(北京索萊寶公司，批號：01-045)，胰蛋白酶(北京瑞達恒輝科技發展有限公司，批號：HB-0103-01)，RPMI-1640培養基(美國GIBCO公司，批號：11875-093)。

1.3實驗方法

1.3.1重組X質粒轉染肝癌HepG2細胞：在10%胎牛血清的DMEN中培養HepG2細胞，胰酶消化后，接種于直徑25 cm培養瓶中，此時計數細胞數為1×106個/L，細胞在6 h后貼壁，之后進行細胞轉染。在37℃預熱的無血清培養基加入5 μg DNA和15 μl Trans Fast Reagent，隨機高速渦旋混勻，在室溫下靜置15 min。培養基被小心移出，之后慢慢向培養瓶中加入混勻的DNA/脂質體的混合物，在37℃孵育24 h后，輕輕加入4 ml含血清的培養基(完全培養基)，不必移去DNA/脂質體混合物，37℃繼續孵育48 h；以HepG2細胞中轉染重組x質粒命名為轉染HBx細胞組(HepG2-HBx組)、未轉染重組x質粒命名為轉染空載體細胞組(HepG2-con組)，未進行任何處理的為空白細胞組(HepG2組)。

1.3.2實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測HBx mRNA的表達：TRIzol試劑提取并收集處于對數生長期的3組肝癌HepG2細胞的HBx mRNA，RNA完整性利用1%的瓊脂糖變性凝膠電泳進行檢測，純度和濃度利用紫外可見分光光度計檢測；在70℃(10 min)、冰育(2 min)、42℃(60 min)、70℃(10 min)反應條件下，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA；在95℃(5 s)、60℃(20 s)、72℃(5 s)進行qRT-PCR反應，40個循環，重復試驗3次。

1.3.3蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測肝癌HepG2細胞中HBx、Notch-1和MRP表達：轉染組和未轉染組進行細胞總蛋白提取，通過Bradford方法調整相同的蛋白濃度后，行電泳獲得根據分子量分離的蛋白條帶，根據pierce公司Western-blot試劑盒的指導說明進行，蛋白NC膜電轉，進行蛋白封閉和一抗結合，一抗結合后洗脫，再進行二抗孵育標記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發光拍照，以β-actin為內參進行系統軟件分析。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖活性：取3組細胞以1×106個/L接種于96孔板中，每孔100 μl，培養48 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，4 h后在450 nm波長下檢測各孔吸光度(OD)值，重復3次取均值。以OD值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3.5流式細胞儀檢測細胞周期：收集轉染48 h后的3組細胞，用冷PBS洗滌細胞后加入體積分數70%冷乙醇固定過夜。采用Cell Quet軟件分析細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.3.6細胞耐藥性檢測：將3組處于對數生長期的HepG2細胞制成濃度為1×106個/L的細胞懸液，每孔100 μl，接種于96孔板，每孔設3個復孔。孵育24 h后，換用濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L絲裂霉素、阿霉素培養液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑培養液。孵育48 h后，去除含藥液，每孔加100 μl不含藥培養基和10 μl CCK-8，設空白孔。孵育2 h后，酶標儀測光密度值，設a為加藥組的OD值，b為不加藥細胞組的OD值，c為無細胞的空白組的OD值，藥物對細胞的抑制率(%)=[1-(a-c)/(b-c)]×100%。計算5種藥物抑制率為50%的濃度(IC50)和耐藥指數(RI)，RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

2 結果

2.1HBx mRNA的表達 將PCR擴增產物進行凝膠電泳，可見HepG2-HBx組有目的片段出現，而其他2組未見HBx mRNA的表達，見圖1。

圖13組肝癌細胞HepG2聚合酶鏈反應擴增產物凝膠電泳結果
A.HepG2組；B.HepG2-con組；C.HepG2-HBx組

2.2HBx、Notch-1和MRP蛋白表達 HepG2-HBx組有HBx蛋白表達，HepG2組和HepG2-con組未見表達。Notch-1和MRP蛋白在HepG2-HBx組條帶最大，HepG2-con組次之，HepG2組最小。見圖2。

圖23組肝癌HepG2細胞中HBx、Notch-1和多藥耐藥蛋白的表達情況

A.HepG2組；B.HepG2-con組；C.HepG2-HBx組

2.3轉染HBx后各組細胞的生長曲線 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組細胞增殖顯著加快(P<0.05)。見表1。

表1 3組肝癌HepG2細胞培養不同時間吸光度值比較

注：與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HepG2-con組比較，cP<0.05

2.4轉染HBx后細胞周期變化 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組G0/G1期細胞顯著減少，S期細胞增加(P<0.05，P<0.01)，G2/M期細胞變化不大(P>0.05)。見表2。

2.5耐藥性 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組中肝癌細胞HeG2對5種藥物耐藥指數增高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表2 3組肝癌HepG2細胞周期變化情況,%)

注：與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01;與HepG2-con組比較，cP<0.05，dP<0.01

表3 3組肝癌HepG2細胞對藥物的敏感性比較

注:IC50為藥物抑制率為50%的濃度，RI為耐藥指數；與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HepG2-con組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

HBV慢性感染是世界范圍內原發性肝細胞癌(HCC)的主要發病原因之一[10-11]，HBx基因致HCC發生的機制是目前研究的熱點。HBx基因具有強大的生物學功能，包括反式激活病毒基因組和宿主細胞基因的轉錄、增強轉錄因子DNA結合特性、抑制p53蛋白活性、參與細胞信號轉導途徑和細胞凋亡的調節等。這些功能可能與HCC的發生具有密切的關系[12]。一些體內及體外研究也發現，HBx可誘導細胞的惡性轉化，甚至參與癌變發生[13]。

在腫瘤的發生、發展過程中，Notch信號出現紊亂時，能夠直接引起腫瘤的發生和發展，且可通過多條信號通路的相互作用，間接誘導腫瘤的形成[14]。本研究qPCR檢測結果顯示，轉染HBx的HepG2細胞內HBx mRNA和蛋白表達明顯，提示轉染構建過表達HBx的肝癌細胞成功。本研究還發現，轉染HBx人肝癌HepG2細胞Notch-1蛋白表達高于HepG2組和HepG2-con組，提示HepG2細胞中HBx過表達誘導了細胞內Notch-1表達水平的增加，造成細胞內Notch信號通路的紊亂。細胞增殖和周期檢測結果顯示，轉染HBx后細胞增殖能力顯著提高，S期細胞增加，提示Notch-1的活化誘導了HepG2細胞增殖的發生。

MDR是導致腫瘤治療失敗和復發的主要原因之一[15-16]。有報道指出，檢測患者體內MRP的表達可以作為監測惡性腫瘤細胞原發性耐藥的主要指標[17]。腫瘤細胞產生MRP與藥物外排泵ABC轉運蛋白的過度表達與細胞凋亡水平異常改變、細胞DNA修復活性增強、胞內酶異常改變和器官微環境改變有密切關系[18]。此外，Notch-1信號與腫瘤細胞MDR的形成有關，過表達Notch-1能增加與MDR相關的ABBCC1基因的表達，誘導MDR的發生[19]。本研究發現，轉染HBx的HepG2細胞耐藥指數明顯增高，提示轉染HBx HepG2細胞，可能通過誘導Notch-1和MRP的過表達，最終導致MDR的發生。此外，在本研究基礎上檢測Notch通路的活化情況及由此引起凋亡抑制蛋白livin表達，同時研究livin的表達后MDR相關蛋白表達的變化,并觀察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及MDR蛋白表達之間的相關性是下一步的研究重點，為乙型肝炎相關性HCC臨床治療提供新靶點。

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