淺談模擬痰標本應用于抗酸染色法

王 娜

（北京衛生職業學院，北京100053）

結核分枝桿菌（M.tuberculosis）俗稱結核桿菌，是結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺臟最多見。據統計，全世界有1/3的人口感染結核分枝桿菌。據WHO報道，每年約有800萬新增病例，至少有300萬人死于肺結核，肺結核已成為醫學檢驗專業重要的教學內容[1]。抗酸染色法是檢驗結核分枝桿菌的常規方法，該法于1882年由埃利F Ehrlich首創，經F·齊爾改進。其中最具代表性的為齊—尼氏染色法和齊爾—加貝特（Ziehl-Gabbet）染色法[2]。目前，抗酸染色法已被廣泛應用于臨床，結核分枝桿菌的抗酸染色法是醫學檢驗專業學生必學、必會的內容。

1 研究原因

結核分枝桿菌傳染性極強，傳播途徑主要有呼吸道、消化道、皮膚和子宮。排菌期肺結核病人的痰液干燥后，細菌隨塵土飛揚，被他人吸入而引起感染。人體吸入含有結核分枝桿菌的飛沫是否患病主要與吸入細菌的數量、毒力、自身抵抗力等多種因素有關，可累及全身多個器官、系統，最常見的部位是肺臟（占80%～90%)，也可累及肝、腎、腦、淋巴結等器官。由于實驗室人員密度大、學生生物安全意識淡薄、自我保護能力差等，增加了實驗教學的生物安全隱患。加之病人痰標本中結核分枝桿菌含量不定，甚至還會有陰性標本，所以實驗課上常會出現檢出率低的情況，無法達到預期教學效果。《傳染病防治法》《醫院感染管理辦法》《醫療機構管理條例》《突發公共衛生事件應急條例》等法律法規規定，醫院對臨床標本應嚴格管理，不得外漏，故學校獲取痰標本的難度非常大。

2 模擬痰標本抗酸染色法

為達到既讓學生學到知識，又保證師生安全的目的，我們經過多次實驗，找到利用模擬痰標本進行抗酸染色教學的方法，具體如下。

2.1 抗酸染色的原理

結核分枝桿菌的細胞壁含有大量脂質（主要是分枝菌酸），它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，需要經過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合后，很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊—尼氏染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結合成復合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。再加入堿性美蘭復染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質則為藍色。

2.2 模擬痰標本片的制備

2.2.1 材料（1）取10 ml正常人痰液，加入40 ml生理鹽水,混勻。（2）卡介苗1支（0.75 mg/ml）。

2.2.2 模擬痰標本制備方法 用注射器將卡介苗吸出，注入50 ml正常人痰液中，制備成痰懸液，采用高壓蒸汽滅菌法（103.4 kpa，121.3℃）滅菌 30 min。

2.2.3 涂片 所需物品：滅菌滴管、載玻片。涂片方法：（1）在干凈的載玻片上用玻璃蠟筆做好標記，以便分清正反面。（2）用滅菌滴管取痰懸液1滴，置于載玻片中央，制成1.0 cm×1.0 cm大小的均勻薄涂片。（3）將涂片置于通風干燥處，自然干燥即可。（4）火焰固定痰涂片。

2.3 抗酸染色步驟

2.3.1 初染 將已固定的痰涂片置于染色架上或用染色夾子夾住，滴加石炭酸復紅染液2～3滴，在火焰上方徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽時移開，若染液蒸發減少，及時添加，加熱3～5 min，待標本冷卻后用水沖洗。

2.3.2 脫色 以3%鹽酸酒精脫色，直至涂片已無紅色染液脫下為止（不可超過10min），用水沖洗。

2.3.3 復染 滴加堿性美蘭溶液蓋滿痰膜，復染1 min，之后用水沖洗，再用吸水紙吸干。

2.4 鏡檢

在淡藍色背景下，抗酸桿菌（結核分枝桿菌）呈紅色，非抗酸菌及細胞等均呈藍色，鏡檢結果見表1。

表1 鏡檢結果

3 模擬痰標本與真正痰標本的陽性檢出率比較

我校于2015年第二學期對模擬痰標本在抗酸染色實驗教學中的應用效果進行研究，并進入試驗階段，2016年正式使用。本文數據統計時間為2014年3月至2017年6月，共7個學期，涉及11個班級。利用模擬痰標本進行抗酸染色實驗教學后，結核分枝桿菌陽性檢出率遠遠高于以往使用真正的痰標本的陽性檢出率，具體見表2。

4 模擬痰標本的優點

4.1 生物安全有保證

教學安全是保證教學效果的第一要素，只有保證了安全才能談效果。實驗教師要消除各種安全隱患，為學生創造一個安全、貼近臨床的實驗環境。模擬痰標本是利用卡介苗制備的，且經過高壓蒸汽滅菌法滅菌，能夠最大限度保證師生安全，消除實驗安全隱患。

表2 模擬痰標本與真正痰標本陽性檢出率比較

4.2 陽性檢出率高，提升了實驗教學效果

提升教學效果是實驗教學的最終目的。使用模擬痰標本后，學生檢出的抗酸桿菌含量均在兩個加號以上，形態典型，且可以通過控制卡介苗的濃度進行調節，不僅做到靈活教學，而且使學生牢固掌握結核分枝桿菌的形態特點，避免未來實習和工作中出現漏檢等問題。

[1]全國衛生專業技術資格考試專家委員會.2017全國衛生專業技術資格考試指導：臨床醫學檢驗與技術（中級）[M].北京：人民衛生出版社，2017.

[2]倪語星，尚紅.臨床微生物學檢驗[M].5版.北京：人民衛生出版社，2013.

[3]支明玉.微生物檢驗技術與實訓指導[M].北京：中國勞動社會保障出版社，2014.