紅菇娘和紫菇娘的組織培養(yǎng)與繁殖

王 波，李 用，呂曉文，姜 成，薛春梅，杜春梅，程海濤，邵 紅，孫長(zhǎng)利，韓誠(chéng)武*

(1.佳木斯大學(xué)微生物研究所，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯 154007；3.佳木斯第二中學(xué)，黑龍江佳木斯 154002)

紅菇娘(CalyxseuFructusPhysalis)為茄科酸漿屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于我國(guó)東北，果實(shí)味甘，微酸，可以食用；全株可入藥，是一種重要的中草藥；野生資源匱乏，人工栽培效率不高[1]，主要通過傳統(tǒng)方式繁殖，如種子繁殖、根莖繁殖等，然而種子發(fā)芽需要1～2年，用吸芽或根莖繁殖也較慢，且繁殖系數(shù)不大，無法突破地域、季節(jié)的限制，使錦燈籠不能完全滿足實(shí)際需要。紫菇娘原產(chǎn)于墨西哥，野生資源匱乏，分布于我國(guó)北部松花江支流之一的通肯河流域中上游局部區(qū)域；為茄科酸漿屬一年生草本植物，暫擬名通肯酸漿(PhysalistungkenensisKuan et Gao)，具有藥用價(jià)值；由于基因型比較復(fù)雜，種子繁殖不易，組織培養(yǎng)成為擴(kuò)大繁殖和保證這2種稀有野生植物種苗數(shù)量和質(zhì)量的有效手段。

近年來紅菇娘果實(shí)達(dá)10～60元/kg， 紫菇娘種子達(dá)1元/粒，市場(chǎng)供不應(yīng)求，通過多方面對(duì)比研究，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖種苗，可降低生產(chǎn)成本，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且對(duì)這2種野生資源的保護(hù)和開發(fā)利用有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1材料供試材料為酸漿屬2個(gè)野生品種，分別為紅菇娘和紫菇娘。

1.2方法

1.2.1紅菇娘。

(1)取材與消毒：剪取野生紅菇娘幼嫩莖和葉，用流水沖洗15 min，在無菌操作臺(tái)上，用70%乙醇消毒10 s，0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗4～5次，切成0.5～1.0 cm，平放于培養(yǎng)基上[2-3]。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：以MS為基本培養(yǎng)基[4]，在不同培養(yǎng)階段分別添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基有MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L；MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照度2 000～4 000 lx，連續(xù)光照12 h/d[5]。

(3)繼代培養(yǎng)：培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同“(2)”。

(4)生根培養(yǎng)：叢生芽分別在MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基(蔗糖減50%)上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察生根情況，測(cè)定根長(zhǎng)，計(jì)算生根率。

1.2.2紫菇娘。

(1)種子萌發(fā)：將預(yù)處理過的種子用75%乙醇消毒15 s，水洗2～3次，用2%次氯酸鈉消毒5 min，水洗3～4次，吸干表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。

(2)取材：取萌發(fā)的無菌苗，切取莖段和幼嫩子葉，平放在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：以MS為基本培養(yǎng)基， 在不同培養(yǎng)階段分別添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基同“1.2.1”。培養(yǎng)條件同“1.2.1”。

(4)繼代培養(yǎng)：培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同“1.2.1”。

(5)生根培養(yǎng)：叢生芽分別在MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察生根情況，測(cè)定根長(zhǎng)，計(jì)算生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1紅菇娘使用幼嫩莖段以及葉片作為外植體培育愈傷組織時(shí)[6]，可以觀察到愈傷組織的形成時(shí)間大約為3 d，形成愈傷組織后，外植體將逐漸變得透明，最后完全變成愈傷組織，形成愈傷組織后，會(huì)長(zhǎng)出叢生芽及根，顏色又逐漸變回綠色。其中以培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L上產(chǎn)生的愈傷組織率、分化率最高。圖1為使用紅菇娘幼嫩莖段及葉片為材料培育的愈傷組織。

圖1 紅菇娘愈傷組織Fig.1 Callus of Calyx seu Fructus Physalis

2.2紫菇娘使用1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行種子萌發(fā)需要7 d左右時(shí)間，相對(duì)于自然狀態(tài)下種子萌發(fā)而言，時(shí)間明顯縮短，并且萌發(fā)率明顯升高。圖2為紫菇娘培養(yǎng)7、9、11 d后種子的萌發(fā)情況。

圖2 紫菇娘培養(yǎng)7、9、11 d后種子萌發(fā)情況Fig.2 The seeds germination of Physalis tungkenensis Kuan et Gao after cultivating 7，9 and 11 days

將無菌子葉切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，分別接種于4種培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后子葉開始膨大彎曲，培養(yǎng)7 d后陸續(xù)產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)10 d時(shí)所試4種培養(yǎng)基上均產(chǎn)生愈傷組織。進(jìn)一步培養(yǎng)約14 d后， 在愈傷組織表面首先分化出綠色芽點(diǎn)，并進(jìn)一步發(fā)育形成不定芽。其中以培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L上產(chǎn)生的愈傷組織率、分化率最高，且能形成大量健壯的不定芽，有利于快速繁殖。圖3為使用紫菇娘幼嫩莖段及葉片為材料培育的愈傷組織。

圖3 紫菇娘愈傷組織Fig.3 Callus of Physalis tungkenensis Kuan et Gao

2.3繼代培養(yǎng)及叢生芽的分化選擇由紅菇娘或紫菇娘的子葉和莖作為外植體經(jīng)過脫分化發(fā)育而來的愈傷組織作為繼代培養(yǎng)的材料。培養(yǎng)基與愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分相同，7 d左右可以明顯觀察到叢生芽以及不定根的出現(xiàn)，但是由于不同激素濃度的促進(jìn)生長(zhǎng)效果不同，叢生芽及根出現(xiàn)的時(shí)間也會(huì)有差異。圖4、5分別為紫菇娘、紅菇娘愈傷組織繼代培養(yǎng)情況。

2.4不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響將紅菇娘和紫菇娘叢生芽放入1/2MS 生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，光照度2 000～4 000 lx，連續(xù)光照 12 h/d，與傳統(tǒng)MS生根培養(yǎng)進(jìn)行比較。在1/2MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2種植物培養(yǎng)5～6 d時(shí)開始生根，從基部和莖節(jié)處產(chǎn)生數(shù)條白色且粗壯不定根，傳統(tǒng)組培10 d后開始生根，生根時(shí)間比傳統(tǒng)組培方式提早1/2，紅菇娘生根率比傳統(tǒng)組培高23%，紫菇娘生根率比傳統(tǒng)組培高30%；且紫菇娘的平均根長(zhǎng)、生根率均高于紅菇娘，1/2MS 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)情況優(yōu)于MS 培養(yǎng)基，可節(jié)約成本。

圖4 紫菇娘愈傷組織繼代培養(yǎng)15 d后的情況Fig.4 Callus of Physalis tungkenensis Kuan et Gao after subculturing 15 days

圖5 紅菇娘愈傷組織繼代培養(yǎng)25 d后的情況Fig.5 Callus of Calyx seu Fructus Physalis after subculturing 25 days

圖6 褐化現(xiàn)象Fig.6 Browning phenomenon

2.5移栽在培養(yǎng)室將紅菇娘和紫菇娘培養(yǎng)瓶的封口膜打開煉苗3 d，然后取出植株，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到盛有滅菌土的花盆里，套袋保濕。大約7 d后，小苗長(zhǎng)出新葉，去除遮蓋，移栽成活率為90 %以上。

2.61/2MS液體培養(yǎng)基中愈傷組織的培養(yǎng)愈傷組織在液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，第5天便可觀察到叢生芽的出現(xiàn)，但是容易發(fā)生褐化現(xiàn)象并長(zhǎng)菌。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)對(duì)2種酸漿屬植物紅菇娘和紫菇娘進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)通過無菌苗途徑得到的愈傷比外植體消毒得到愈傷的生長(zhǎng)狀態(tài)好一些。在愈傷原誘導(dǎo)的環(huán)節(jié)中，葉片誘導(dǎo)率沒有莖段高，且誘導(dǎo)時(shí)間稍長(zhǎng)，但是由于面積比較大，葉片叢生芽的誘導(dǎo)率相對(duì)高一些。且無論是誘導(dǎo)時(shí)間，還是誘導(dǎo)率，紫菇娘都好于紅菇娘，愈傷組織和叢生芽綠色較深，叢生芽增殖率也略高。相對(duì)而言，叢生芽誘導(dǎo)是較好途徑。MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L為最適合紅菇娘愈傷組織誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基，而紫菇娘是MS +6-BA 3.0 mg/L和NAA0.03 mg/L，培養(yǎng)14 d后每個(gè)愈傷組織能產(chǎn)生3～5個(gè)不定芽。繼代和生根培養(yǎng)后，叢生芽的成活率為90%以上。

[1] 王波，司亮，羅志文.組織培養(yǎng)在花卉研究中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(溫室園藝)，2012(10):40，42， 44，46.

[2] 黃海波，淡明，郭安平，等.植物組織培養(yǎng)中存在的主要問題與對(duì)策[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，34(12):2632-2633.

[3] 胡凱，張立軍，白雪梅，等.植物組織培養(yǎng)污染原因分析及外植體的消毒[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，35(3):680-681.

[4] 王波，王鶴，譚巍，等.仙客來的組織培養(yǎng)及植株再生[J].北方園藝，2007(1):166-167.

[5] FREIBURGHAUS F，KAMINSKY R，NKUNYA M H，et al.Evaluation of African medicinal plants for their in vitro trypanocidal activity[J].Journal of ethnopharmacology,1996,55(1):1-11.

[6] 王喆之，張大力，郝聯(lián)芳.離體條件下燈籠果花芽形成及開花的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，1991，11(2):129-133.