產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶工藝優(yōu)化

曲均革， 馬佳慧， 劉冰雪

(浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校制藥工程學(xué)院，浙江寧波 315100)

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，可以將蛋白質(zhì)分解成蛋白胨、多肽以及游離氨基酸，是目前應(yīng)用最普遍的酶制劑之一。蛋白酶與人類生活關(guān)系密切，從生物體生理活動(dòng)到疾病發(fā)生等很多方面都受到蛋白酶的影響，例如食物的消化和吸收、細(xì)胞分化和自溶、機(jī)體衰老、血液凝固、溶血作用、血壓調(diào)節(jié)、炎癥、癌癥轉(zhuǎn)移等[1-2]。目前，我國已有20多種蛋白酶應(yīng)用于食品、化妝品、洗滌劑、水產(chǎn)、飼料等領(lǐng)域。對近年來國內(nèi)外對微生物蛋白酶的研究趨勢進(jìn)行分析可知，新品種開發(fā)仍是研究蛋白酶的重中之重[3-4]。筆者從寧波洋沙山和象山海域采集樣品，最終分離到一株高產(chǎn)蛋白酶的海洋細(xì)菌，對其進(jìn)行菌種鑒定，并對其發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。從寧波洋沙山和象山海域采集海水樣品。

1.1.2培養(yǎng)基。

1.1.2.1富集、活化、發(fā)酵培養(yǎng)基。2216E液體培養(yǎng)基，具體組成如下：蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、磷酸高鐵0.01 g/L，人工海水定容，pH 7.6～7.8。

1.1.2.2分離培養(yǎng)基。酪蛋白固體培養(yǎng)基，具體組成如下：酪蛋白4.0 g/L、磷酸二氫鉀0.36 g/L、磷酸氫二鈉1.3 g/L、七水合硫酸鋅0.02 g/L、七水合氯化鈣0.002 g/L、酪蛋白水解物0.05 g/L，瓊脂18 g/L，人工海水定容，pH 7.2～7.4[5]。

1.2方法

1.2.1富集培養(yǎng)。分別吸取1 mL象山海水和洋沙山海水接入2216E液體培養(yǎng)基中，置于搖床(150 r/min、25 ℃)培養(yǎng)24 h。

1.2.2初篩——平板透明圈法。用無菌海水按10倍連續(xù)梯度稀釋法將富集培養(yǎng)后的菌懸液稀釋至10-8，分別取0.1 mL 10-4～10-8稀釋液，涂布接種于酪蛋白固體培養(yǎng)基上。于25 ℃下培養(yǎng)48 h后，挑選透明圈直徑與菌落直徑比值(Hc)較大的菌落，經(jīng)平板分區(qū)劃線分離法純化后，在2216E斜面上保藏[6-9]。

1.2.3復(fù)篩——酶活力測定法。

1.2.3.1粗酶液制備。挑取初篩后有活性的菌株，將其轉(zhuǎn)接于2216E培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。以2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/250 mL錐形瓶)，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，得粗酶液[10]。

1.2.3.2蛋白酶活力測定。

(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度(20～100 μg/mL)酪氨酸溶液各1 mL，分別加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL、福林酚1 mL，置于40 ℃恒溫水浴保溫顯色20 min，在660 nm處測吸收值。用空白管(只加水，碳酸鈉溶液和福林酚試劑)作為對照，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

(2)酶活力測定。在1 mL粗酶液中加入1 mL 2%(W/V)酪蛋白溶液(不同pH緩沖液配制)，40 ℃水浴反應(yīng)10 min，再加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。將混合液置于40 ℃水浴中繼續(xù)保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀完全后離心，取1 mL上清液加入5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3溶液和1 mL福林酚試劑，將試管振蕩均勻后，于40 ℃保溫發(fā)色20 min后，在660 nm處測定OD值，計(jì)算蛋白酶活力。同時(shí)另做1支空白管，空白管是將粗酶液換成發(fā)酵培養(yǎng)基1 mL，其他步驟同上。由上述條件規(guī)定，1 mL 酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸為 1個(gè)酶活力單位(U)[10]。

1.2.4菌株發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.4.1裝液量對菌株產(chǎn)酶活力的影響。在250 mL 的三角瓶中分別裝入 12.5、25.0、50.0、75.0和100.0 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min、25 ℃恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力。

1.2.4.2接種量對菌株產(chǎn)酶活力的影響。分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量接入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min、25 ℃恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力。

1.2.4.3培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。分別以15、20、25、30、35 ℃為發(fā)酵溫度進(jìn)行培養(yǎng)，0.5%的接種量，其他條件維持不變，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力。

1.2.4.4培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)到3、4、5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)溫度為20 ℃，其他條件維持不變，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力。

1.2.4.5搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響。將搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)到 100、150、200 r/min，培養(yǎng)基pH 7，其他條件維持不變，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力。

1.2.4.6發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響。分別選擇 0、8、16、24、32、40 h 為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)速100 r/min，其他條件維持不變，每組3個(gè)平行，測定粗酶液酶活力[10-11]。

1.2.5酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.2.5.1酶反應(yīng)最適pH測定。將酶液與不同pH緩沖液配制的一系列底物在40 ℃保溫，通過測定酶活力，得到酶反應(yīng)的最適pH及pH對酶活力的影響。

1.2.5.2酶pH的穩(wěn)定性測定。將酶液置于pH 3～10的不同緩沖液配制的一系列底物中，于40 ℃保溫 60 min，測定剩余酶活力。

1.2.5.3酶反應(yīng)的最適溫度測定。在20～90 ℃內(nèi)，以10 ℃為間隔,在不同溫度條件下將酶液與底物在pH 為10的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng),測酶活力。

1.2.5.4酶反應(yīng)溫度的穩(wěn)定性測定。將酶液在不同溫度下保溫60 min后測剩余酶活力。相對酶活力以同一指標(biāo)中最高的酶活值為100%[11-12]。

1.2.6菌種鑒定。將分離菌株在2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d,采用TaKaRa細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒對菌株進(jìn)行基因組DNA提取。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 保守序列,合成PCR擴(kuò)增引物如下：上游引物F8(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),下游引物R1492(5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’) 。

反應(yīng)體系(50 μL)：25 μL 2×緩沖液(Mg2+plus),8 μL dNTPs 混合物(2.5 μmol/L),1 μL 引物F8和R1492(20 μmol/L),2 μL 模板DNA,0.5 μL LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)和13.5 μL 的無菌水。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,55 ℃1 min,72 ℃ 2 min,共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。16S rDNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化后進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果與NCBI的GenBank 進(jìn)行BLAST 分析,選取相似度相近及層次差異序列進(jìn)行分析，并選用Escherichiacolistrain ATCC35469(KP941759) 16S rDNA序列為外群。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選結(jié)果用平板透明圈法初篩共得到15株能夠產(chǎn)蛋白酶的菌株，其中Hc為10的有3株，Hc大于7的有3株，Hc小于5的有3株。取其中Hc較高的菌株進(jìn)行發(fā)酵,測定粗酶液的酶活力,最后選取酶活力最高的PB02進(jìn)行深入研究。

2.2菌株鑒定結(jié)果采用序列分析軟件MEGA5.05 Alignment 程序?qū)φ淼男蛄羞M(jìn)行核酸序列比對，進(jìn)一步使用Phylogeny程序，以Neighbor-Joining Tree法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

由圖1可知，PB02 16S rDNA與交替假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)物種差異最低，相似度最高，可能為其中的一株未測序或新菌種。

圖1 PB02系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of PB02

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1裝液量對菌株產(chǎn)酶活力的影響。由圖2可知，裝液量為25.0 mL時(shí)，所測得的蛋白酶酶活力最高；當(dāng)裝液量多于25.0 mL 時(shí)，酶活力開始有逐漸下降的趨勢，這可能是由于裝液量過高使得培養(yǎng)液的溶氧量降低。所以，以25.0 mL的裝液量為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的最佳裝液量。

圖2 裝液量對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.2 Effects of loading volume on the enzyme activity of the strain

2.3.2接種量對菌株產(chǎn)酶活力的影響。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，較大的接種量可使菌體快速地進(jìn)入穩(wěn)定期，但也可以使生長繁殖的時(shí)間縮短；較小的接種量可以使對數(shù)生長期延長。由圖3可知，以0.5%的接種量為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的最適接種量。

圖3 接種量對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.3 Effects of inoculum size on the enzyme activity of the strain

2.3.3培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。溫度既對菌體生長有一定的影響，也對酶活力有重要的影響。由圖4可知，當(dāng)溫度為 15～20 ℃時(shí)，蛋白酶酶活力隨溫度的增加有升高的趨勢；當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，酶活力有下降的趨勢；以20 ℃發(fā)酵時(shí)，測得的蛋白酶酶活最高。所以確定20 ℃作為發(fā)酵培養(yǎng)的最適溫度。

2.3.4培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響。由圖5可知，當(dāng)初始pH為6～7時(shí)，蛋白酶酶活力隨初始 pH 的增大出現(xiàn)升高的趨勢；初始pH 高于7時(shí)，酶活力有逐漸下降的趨勢；初始pH為7時(shí)，測得的蛋白酶酶活力最高，所以確定7作為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH。

2.3.5搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響。搖床振蕩培養(yǎng)能夠使菌體與培養(yǎng)基充分接觸，增加溶氧量，滿足菌體的生長需求。底物可以更好地在體系內(nèi)轉(zhuǎn)移和發(fā)揮作用，有利于對不同參數(shù)的取樣測定。由圖6可知，以100 r/min的轉(zhuǎn)速為搖瓶發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the enzyme activity of the strain

圖5 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.5 Effects of the initial pH of the medium on the enzyme activity of the strain

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.6 Effects of rotation speed on the enzyme activity of the strain

2.3.6發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響。發(fā)酵時(shí)間分為兩個(gè)階段，一是菌體的生長階段，二是發(fā)酵產(chǎn)酶階段。由圖7可知，發(fā)酵時(shí)間為0～16 h 時(shí)酶活力逐漸提高，說明這時(shí)的菌體數(shù)不斷增加；發(fā)酵時(shí)間為16～32 h 時(shí)酶活力平緩下降，其中16 h 時(shí)酶活力最高，因此確定發(fā)酵時(shí)間16 h作為發(fā)酵培養(yǎng)的最適產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間。

2.4酶活性質(zhì)研究

2.4.1酶反應(yīng)最適pH測定。將酶液與不同pH緩沖液配制的一系列底物在40 ℃保溫，測得的酶活力結(jié)果表明：酶反應(yīng)的最適pH為10，在pH為7～9時(shí)具有穩(wěn)定的、較高的酶活力，能保持最適pH時(shí)的70%以上,pH為7、8時(shí)，酶活力為最適pH時(shí)的94%，而pH為6時(shí)，酶活力僅為最適pH時(shí)的40%,說明 PB02產(chǎn)生的為堿性蛋白酶(圖8)。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of fermentation time on the enzyme activity of the strain

圖8 pH對蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of pH on activity and stability of protease

2.4.2酶的pH穩(wěn)定性測定。將酶液置于不同pH環(huán)境中保溫60 min，測定剩余酶活力結(jié)果表明:該菌產(chǎn)酶在pH為7～10內(nèi)，酶活力均可保持在62%以上(圖8)。

2.4.3酶反應(yīng)最適溫度測定。不同溫度條件下的酶促反應(yīng)結(jié)果表明：最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～60 ℃內(nèi)具有較高的酶活力,可保持在最適溫度時(shí)的79%以上,而當(dāng)溫度升高至60 ℃時(shí)，酶活力急劇下降至最適溫度時(shí)的27%(圖9)。

2.4.4酶的熱穩(wěn)定性測定。將酶液在不同溫度下保溫60 min后測剩余酶活力，發(fā)現(xiàn)溫度超過60 ℃以后，酶活力下降很快，30～60 ℃時(shí)酶活保持84%以上，而90 ℃時(shí)酶活力下降至30%(圖9)。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)分別從洋沙山和象山海域采集海洋樣品進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選，初篩共得到15株蛋白酶活性菌株，其中1株酶活較高的菌株P(guān)B02經(jīng)16S rDNA鑒定為交替假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)。通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化得出，PB02號(hào)菌培養(yǎng)的最適pH為7，0.5%的接種量，10%的裝液量，20 ℃的培養(yǎng)溫度，100 r/min的搖床轉(zhuǎn)速，發(fā)酵時(shí)間16 h最利于產(chǎn)酶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，PB02號(hào)菌產(chǎn)生的為堿性蛋白酶，酶反應(yīng)的最適pH為10，蛋白酶在pH為7～9時(shí)具有穩(wěn)定的酶活力，能保持最適pH 的70%以上。PB02號(hào)菌株不耐高溫，酶反應(yīng)的最適溫度為40 ℃。該研究為今后對產(chǎn)蛋白酶海洋活性菌株的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

圖9 溫度對蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of temperature on activity and stability of protease

[1] 胡學(xué)智,王俊.蛋白酶生產(chǎn)和應(yīng)用的進(jìn)展[J].工業(yè)微生物,2008,38(4):49-61.

[2] 路英華.蛋白酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)信息,1991,8(2):8-10.

[3] NASCIMENTO W C A，MARTINS M L L.Production and properties of an extracellular protease from thermophilicBacillussp[J].Brazilian journal of microbiolgy,2004,35:91-96.

[4] RAI S K,ROY J K,MUKHERJEE A K.Characterisation of a detergent-stable alkaline protease from a novel thermophilic strainPaenibacillustezpurensissp.nov.AS-S24-Ⅱ[J].Applied microbiology and biotechnology,2010,85(5):1437-1450.

[5] 張曉.海洋產(chǎn)蛋白酶菌的分離、培養(yǎng)及其防污活性研究[M].青島：中國海洋大學(xué),2013:12.

[6] 劉婷,張?zhí)毂?林元山.產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(5):102-104,107.

[7] 張銳.極端微生物產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2001,28(4):5-9.

[8] 萬琦,陸兆新,高宏.低溫堿性蛋白酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J].微生物學(xué)雜志,2002，22(5):16-18.

[9] 宋明徽.產(chǎn)堿性蛋白酶海洋細(xì)菌篩選及發(fā)酵研究[M].大連：大連工業(yè)大學(xué),2013:12-14.

[10] 張力元.海洋來源產(chǎn)蛋白酶的菌株篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究[M].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2009:20-47.

[11] 方春玉,周健,鄧靜,等.瀘型大曲黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶條件的優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(2):13-19.

[12] 曲均革,姚曉敏,朱鵬,等.產(chǎn)纖維素酶海洋細(xì)菌的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,21(6):1054-1056.