柑橘皮渣發酵蛋白質飼料(SCP)工藝優化及光照對發酵飼料的影響

劉智萍,茍 凱,周月明,2*,陳猷鵬,2,郭勁松,2,程 錦

(1.重慶大學城市建設與環境工程學院，重慶 400045; 2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，重慶 400714)

我國是柑橘的重要原產地之一，據統計，2009年我國柑橘種植面積203.1萬hm2，產量已達2 520萬t，面積和產量均位居世界第一[1-2]。柑橘除直接食用外，大部分用于果汁加工，隨著柑橘原汁產量的增加，柑橘加工的副產品柑橘皮渣的量隨之增加，據統計我國柑橘每年約有100萬t用于果汁加工，產生50萬t柑橘皮渣，柑橘渣含水量高，容易變質腐爛，長期保存和長途運輸比較困難，大量的柑橘皮渣嚴重影響人們的生產、生活及健康[3-4]。麩皮為小麥最外層的表皮，是面粉生產的主要副產物。其對氨基苯甲酸含量是植物中最高的，有恢復皮毛顏色的作用，常用作動物飼料[5]。

單細胞蛋白(singlecell protein，SCP)是通過培養大量細菌、酵母、其他真菌或者藻類，從中提取出的蛋白質或生物菌體，作為一種人和動物的蛋白來源添加到人類食品和動物飼料中[6]。單細胞蛋白所含的營養物質豐富，粗蛋白含量一般在30%～45%，此外還含有未知生長因子[7]。

國內外對微生物發酵生產蛋白飼料已進行了初步研究[8]。Vaccarino等[9]研究綠色木霉(Trichodermaviride)和白地霉(Geotrichumcandidum)發酵柑橘皮生產單細胞飼料的最佳條件，在溫度28 ℃、pH 5.5、發酵時間60 h條件下，發酵產物中粗蛋白含量提升到20%。Nwabueze等[10]發現柑橘皮渣可以促進釀酒酵母的生長，在pH 5.5、溫度36 ℃、時間12 h條件下，得到粗蛋白含量為57%的單細胞蛋白產品，粗蛋白含量大大提高。周煉等[11]發現當產朊假絲酵母(Candidautilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、康寧木霉(Trichodermakonigii)混合比例為3∶1∶2時，粗蛋白含量是純培養的3～4倍。殷鐘意等[12]研究表明單一菌種發酵不如混合菌種發酵的效果，當發酵菌種為A.niger、米曲霉(Aspergillusoryzae)和扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)時，粗蛋白含量可從10.00%提高到34.40%。李赤翎等[13]發現通過添加酵母可以將粗蛋白含量從8.17%提高到28.06%，粗蛋白提升明顯。王帥[3]發現柑橘皮渣發酵飼料可以促進仔豬腸絨毛的生長發育，以及營養物質的消化和吸收，從而提高營養物質的利用率。通過以上學者的研究，可以看出多菌種混合發酵柑橘皮渣具有明顯優勢，可以顯著提高產品粗蛋白的含量[14]。

據報道，真菌對光的反應不一，光照既可刺激真菌發育，也可抑制真菌發育[15-16]，并受其他環境因子或營養因子的影響[17-18]，光照顯著影響氨基酸和糖類的質量和含量。在P.blakesleeanus中，光照降低鳥氨酸脫羧酶活性[19]。在B.emersonii中，光激活多糖合成和降低葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性[21]。在T.viride中，谷氨酸脫羧酶被光誘導，該酶催化L-谷氨酸α-脫羧變為γ-氨基酪酸[19，21]。在T.harzianum中，經光照后在分生孢子發生階段磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶被下調[22]。Envoy不僅對光強烈地響應，而且顯著影響纖維素酶基因的表達[23]?？傊?，真菌所需光強一般為10～1 500 lx，最佳光強因真菌種類而異[24-26]。國內尚少見學者研究光強對微生物發酵柑橘皮渣生產蛋白質飼料的影響。

以柑橘廢渣為主料，麩皮為輔料，通過固體發酵技術生產單細胞蛋白飼料，首先，對發酵混菌的最佳比例進行優化，在此基礎上通過單因子變量法逐步優化固態發酵工藝，得到高品質蛋白質飼料。在最佳發酵條件下，考察光照強度對發酵飼料的影響，探索提高飼料品質的新方法，對提高廢棄物資源化利用效率，解決我國蛋白飼料短缺問題，以及提高蛋白質飼料品質都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1原料與菌種柑橘皮渣：榨汁剩余的皮渣，采自重慶長壽柑橘加工園區，作為發酵的主要原料。麩皮：重慶長壽農業園區面粉廠加工后剩余的麩皮，作為發酵的輔助原料。菌種：康寧木霉(T.konigii)、米曲霉(A.oryzae)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)以及球擬圓酵母(T.globose)。T.konigii主要功能是降解粗纖維，A.oryzae主要功能是降解果膠，菌株功能由實驗室其他人員經過試驗得出。

1.2培養基果膠固體培養基[25]，馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基[26]，纖維素固體培養基[26]，酵母膏蛋白胨固體培養基[27]。

1.3研究方法

1.3.1成分測定方法。粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、灰分的測定采用國家標準GB/T 5915-2008的方法[28]。果膠含量采用咔唑比色法[29]。有機碳(TOC)、總氮(TN)、總磷(TP)、氫(H)、硫(S)、鉀(K)采用元素分析儀測定。

1.3.2發酵方法。

(1)菌種復蘇。挑取菌體，用劃線法接種在對應固體培養基上，置于培養箱中，在30 ℃下培養48 h，至平板上出現明顯菌絲。

(2)種子液制備。挑取固體培養基上生長良好的菌落接種到對應液體培養基中，放置于溫度30 ℃、轉速160 r/min的搖床中培養24 h。

(3)固態發酵。把種子液按比例接種到發酵基質中，調節培養基含水率，攪拌均勻后置于培養箱中按照所需溫度及時間發酵，產物于55 ℃烘干，備用。

1.4發酵條件優化

1.4.1初始發酵條件。柑橘皮渣發酵蛋白質飼料的初始條件：自然pH條件下，溫度30 ℃，菌液接種量0.5mL/g，柑橘皮渣質量比例16%，麩皮質量比例4% ，含水率質量80%，時間3 d。發酵結束后，發酵產物在55 ℃下烘干至恒重，然后對發酵產物進行成分分析。

1.4.2發酵條件優化。采用單因子變量法逐步優化發酵試驗條件。發酵時間：48、60、72、84、96 h；發酵溫度：27、30、33、36、39、42 ℃；培養基含水率：50%、60%、70%、80%、90%；菌液接種量：0.1、0.2 、0.3 、0.4、0.5 、0.6 mL/g；光照強度：1 000、2 500、10 000 lx。

2 結果與分析

2.1柑橘皮渣主要成分分析對柑橘皮渣主要成分的含量進行測定，結果表明：除含水率為4.84%外，其他成分以干物質質量計，其中粗蛋白含量僅為11.86%，含量較低；粗纖維、果膠、粗脂肪分別為27.40%、9.47%、3.81%；TP、H、S、K、TOC、TN的含量分別為0.18%、6.74%、0.40%、0.45%、39.59%、0.80%。

2.2最佳菌種篩選與組合

2.2.1單菌發酵結果。設置空白組和試驗組，空白組用無菌水代替菌液按照0.5 mL/g接種到發酵基質中，試驗組分別接種0.5 mL/g 的T.globosa、A.oryzae、T.konigii、C.tropicalis菌液到發酵基質中，在初始發酵條件下，在絕干基礎上測定粗蛋白含量，結果表明空白組粗蛋白含量為14.63%，4株菌發酵后粗蛋白含量都有所上升，但是T.globosa發酵后粗蛋白含量僅提高了2.19百分點，其他3株菌發酵后粗蛋白含量都提高了4.67百分點以上，其中A.oryzae、T.konigii菌液處理的粗蛋白含量分別為19.90%、19.30%；C.tropicalis發酵后粗蛋白含量最高，達到了25.50%。

2.2.2多菌種發酵結果。保持上述試驗條件不變的情況下，接種液總量不變，不同菌種按等比例接種(例如：組A中T.globosa與T.konigii按照0.25 mL/g分別接種到發酵基質中)，發酵結果如表1所示。

表1 多菌種發酵后粗蛋白含量

注：粗蛋白含量在絕干基礎上測得

Note:Crude protein content was determinated based on absolute dry

由表1可以看出，6種組合發酵產品粗蛋白含量較單菌發酵都有明顯提高，其中E組發酵效果最好，粗蛋白含量提高了14.67百分點，說明T.konigii、C.tropicalis和A.oryzae具有較好的兼容性，3株菌間的協同作用使粗蛋白的轉化率大大提升，且多菌株組合具有更好的生物穩定性[30]。因此，后續試驗選取T.konigii、C.tropicalis、A.oryzae3株菌的組合作為發酵混菌。

2.2.3發酵混菌比例優化。選用T.konigii、C.tropicalis、A.oryzae3株菌分別按照1∶1∶1、2∶2∶1、1∶2∶2、2∶1∶2比例混合，菌液接種總量為0.5 mg/L，其他條件不變，結果如表2所示。

由表2可以看出，第2組發酵產生的粗蛋白含量最高為32.89%，通過對比可以發現T.konigii和A.oryzae比例較高的時候，發酵產物粗蛋白含量較低，這主要是因為A.oryzae主要作用是分解果膠[31]，T.konigii主要作用是分解纖維素[32]，這2株菌生產蛋白的能力較差，當混菌中這2株菌的含量較高時，粗蛋白的生產能力較差，而果膠和纖維素的分解能力較強；當C.tropicalis比例較高時，發酵產物粗蛋白含量較高，這主要是因為C.tropicalis主要作用是生產蛋白質。另外，第3組發酵后粗蛋白含量比第2組低2.75百分點，推測可能是因為原料中果膠含量為9.47%，而纖維素含量較高為27.40%(表2)。當T.konigii含量較高時，混菌能將更多的纖維素大分子分解成小分子，為生產蛋白質提供更多容易被利用的小分子物質，所以第2組優于第3組，主要是因為原料中粗纖維含量高于果膠含量。

表2 發酵混菌比例優化

注：粗蛋白含量在絕干基礎上測得

Note:Crude protein content was determinated based on absolute dry

2.3最佳發酵條件的篩選采用單因子變量法逐步優化發酵條件。

2.3.1時間對發酵飼料品質的影響。當發酵條件為30 ℃、自然pH、含水率80%、菌液接種量0.5 mL/g、T.konigii∶C.tropicalis∶A.oryza= 2∶2∶1時，結果如圖1所示。在48～84 h階段，粗蛋白、粗脂肪含量增長顯著，同時粗纖維含量急劇下降，在此階段微生物充分利用基質中的營養物質，快速合成蛋白質。84 h以后，粗蛋白、粗脂肪含量趨于穩定，主要因為營養物質含量與微生物濃度達到平衡，微生物生長進入穩定期。因此，后續試驗選取84 h為最佳發酵時間。

圖1 發酵時間對飼料成分的影響Fig.1 Impact of fermentation time on feed ingredients

2.3.2環境溫度對發酵飼料品質的影響。從圖2可以看出，當溫度在30～42 ℃時，粗纖維含量都低于15.41%，該溫度范圍適合粗纖維的降解。而粗蛋白、粗脂肪含量在33 ℃最高，推測原因是33 ℃酶的活性較高，促進了粗蛋白和粗脂肪的生產。因此，后續試驗選取33 ℃作為最佳發酵環境溫度。

圖2 溫度對飼料成分的影響Fig.2 Impact of fermentation temperature on feed ingredients

2.3.3培養基初始含水率對發酵飼料品質的影響。由圖3可見，當含水率為70%時，發酵產品粗蛋白、粗脂肪含量最高，粗纖維含量最低，主要是因為含水率為70%時，原料的松散度較好，適宜的孔隙有利于物質和氧氣傳遞，當培養基含水率低于70%時，原料膨脹度降低，影響物質的傳遞，且水分含量不足以支持微生物生長。同時,過高的含水量導致培養基呈漿狀混合物，孔隙度降低，氧氣傳遞速率降低，微生物的代謝受到抑制，所以該研究采用70%為最佳含水率。

圖3 含水率對飼料成分的影響Fig.3 Impact of moisture content on feed ingredients

2.3.4菌液投加量對發酵飼料品質的影響。從圖4可以看出，菌液接種量在0.1～0.4 mL/g，隨著菌液投加量增加，粗蛋白、粗脂肪含量隨之增大，粗纖維含量隨之降低，微生物與基質逐步達到平衡；接種量超過0.4 mL/g后，粗蛋白和粗脂肪含量下降，同時粗纖維含量增大，其原因可能是微生物濃度過大，原料中的營養物質濃度有限，不能滿足所有微生物的生長需求，微生物生長和降解粗纖維能力受限，所以選擇0.4 mL/g作為最佳接種量。

圖4 菌液投加量對飼料成分的影響Fig.4 Impact of microbial added concentration on feed ingredients

研究得到的最佳發酵條件為：菌株投加比例T.konigii∶C.tropicalis∶A.oryzae=2∶2∶1，發酵時間84 h，溫度33 ℃，含水率70%，菌液接種量0.4 mL/g，在此條件下，微生物生產蛋白質和脂肪以及降解粗纖維的能力最強，發酵后飼料中粗蛋白含量達到35.03%，粗脂肪含量達到4.92%，同時粗纖維含量低至12.08%。

2.4光照對發酵飼料品質的影響在不同光照強度下，研究粗蛋白、粗纖維、粗脂肪含量的變化特征，其他發酵條件均采用最佳條件。

圖5 光照強度對于發酵結果的影響Fig.5 Impact of crude protein and crude fiber by light intensity

光照強度對發酵飼料的影響是在試驗過程中偶然發現的。由圖5可以得出，在光照強度為2 500 lx時，發酵后粗蛋白與粗脂肪含量達到最高,分別為36.42%、4.96%，與上文無光照試驗結果相比，粗蛋白和粗脂肪分別提高了1.39百分點和0.04百分點，說明微生物在2 500 lx的光強下生產蛋白和脂肪的能力增強。當光照強度為1 000 lx時，粗蛋白與粗脂肪含量與無光照試驗一致，說明大于1 000 lx的光強才對微生物生產蛋白和脂肪能力有一定促進作用，已有研究也有類似的報道，非光合微生物在光照刺激下活性增強，例如尹冬雪等[33]在2012年研究光照強度對豬糞、牛糞厭氧發酵的影響，發現光照條件比黑暗條件能產生更多的沼氣，光照對微生物生長代謝具有顯著影響。說明光照條件對非光合微生物的活性有一定的促進作用。當光照強度為10 000 lx時，粗蛋白與粗脂肪含量較無光照試驗分別降低了13.30百分點和1.43百分點，說明光強過大時，微生物生產蛋白質和脂肪的能力都受到抑制。

由圖5還可以看出，光照條件下，發酵飼料中粗纖維含量都高于13.32%，且隨著光照強度增加，粗纖維含量越來越高，均高于無光照條件下發酵飼料中粗纖維的含量(12.08%)，說明光照條件不利于粗纖維的降解，推測原因可能是微生物在光照條件下產纖維素酶、半纖維素酶的能力受到抑制，導致纖維素降解率降低，含量上升。通過以上分析可以發現，光照條件對非光合微生物發酵飼料既有促進作用又有抑制作用，作用機理需要進一步研究才能得出。

3 結論

從熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、康寧木霉(Trichodermakonigii)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、球擬圓酵母(Torulopsisglobosa)4株菌中，優選出效果最佳的菌株并優化菌株最佳混合比例，確定T.konigii∶C.tropicalis∶A.oryzae最優比例為2∶2∶1，發酵時間84 h，溫度33 ℃，含水率70%，菌液接種量0.4 mL/g，發酵后粗蛋白含量達到35.03%，粗脂肪含量達到4.92%，同時粗纖維含量為12.08%。通過光照強度對發酵飼料的影響試驗可知，光強在1 000～2 500 lx時，可以促進微生物生產蛋白質和脂肪，當光強為10 000 lx時，微生物生產蛋白質和脂肪的能力受到抑制；另外，光照條件不利于粗纖維的降解，可能由于光照抑制了微生物產纖維素酶、木質素酶或者半纖維素酶的活性，光強對3株菌發酵蛋白質飼料的影響機理還需要進一步的研究。

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