植物抗病研究進展與展望

劉 潮, 韓利紅, 褚洪龍, 王海波, 高 永, 唐利洲

(曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心, 云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室, 曲靖 655011)

植物在其生命周期中,會經受多種微生物病原和植食性昆蟲的侵襲,然而特定的植物種卻對大多數病原表現出抗性,只對極少數表現感病性,這是因為植物在與病原互作的協同進化過程中發展出一套有效的先天免疫系統[1]。培育具有廣譜而持久抗性的植物品種是育種學家一直以來追求的目標。植物對病原的遺傳抗性由主效基因和QTLs控制,主要的抗性基因(resistance gene,R gene)能抵御含無毒基因(avr)的病原真菌,由于avr高度可變,經常導致菌株變異而突破R基因的抗御。與此相反,非寄主抗性使植物保持對大多數病原物的抗性[2-3],抗病基因使植物保持對病原廣譜而持久的抗性[4-5],microRNA(miRNA)的轉錄后調控功能決定了其在植物抗病過程中的作用[6-8],感病基因的改變能使植物對病原產生廣譜持久抗性[9-10]。隨著研究的深入,目前對植物抗病的分子機理的研究取得了許多突破性進展,本文圍繞近期在非寄主抗性基因、抗病基因、miRNA、感病基因等相關的植物抗病性方面的最新研究進行綜述,并對未來發展方向提出展望,這對植物抗病性研究及植物品種改良具有重要的指導意義。

1 非寄主抗性

非寄主抗性是在物種水平上表現出的廣譜的植物防御性。主要包括預制防御(preformed defense)、誘導防御和非寄主抗性基因介導的植物抗病性。

預制防御是非寄主抗性最重要的部分,包括物理限制和病原物的化學抑制。植物通過持續產生次級代謝物等抗菌成分抑制寄主和非寄主病原物的生長。植保素是病原侵染之前植物表面分泌的主要次級代謝物[11]。十字花科植物組成型表達的硫代葡萄糖苷及其衍生物在對多種病原菌的防御中起重要作用[12-13]。這些預制組織結構和化學成分在植物非寄主抗性中發揮重要作用。誘導防御是通過病原誘導植物產生結構屏障,包括胼胝質、木質素、木栓素等細胞壁強化成分,以及誘導多種抗菌化合物屏障或信號等。非寄主病原細菌接種擬南芥Arabidopsisthaliana之后,木質素合成相關基因PAL1和藍銅結合蛋白基因BCB表達上調[14]。

非寄主抗性基因是植物實現非寄主抗病性的重要內容。經篩選對丁香假單胞菌Pseudomonassyringae抗性降低的擬南芥突變體,獲得了丙三醇激酶nho突變系,該突變體喪失了對P.syringae的非寄主抗性[15]。PcAvr3a1介導了煙草屬植物對辣椒疫霉Phytophthoracapsici的非寄主抗性[16],I2多基因家族以及EDS1和SGT1也與寄主抗性有關[17]。2個萵苣QTLs在植株發育的整個階段存在對白粉病菌的抗性[4]。需要注意的是,大多數情況下非寄主抗性基因沉默或突變往往只是部分降低了非寄主抗性,這與非寄主抗性多屬于數量性狀且由多個基因控制有關[18]。

病原相關的模式分子引發的免疫反應(pathogen associated molecular pattern triggered immunity,PTI)在植物非寄主抗性中發揮重要的作用。植物的識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)能識別病原物表面的相關模式分子(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),觸發PTI,包括細胞壁增厚、細胞壁木質化、植保素的產生和PR基因的誘導表達等。目前3個PRRs(FLS2、EF-Tu receptor、Xa21)已被鑒定[19],這些PRRs能在不同的物種中起作用。如表達擬南芥類受體蛋白激酶(EF-Tu receptor,EFR)的轉基因番茄和煙草能感知多種寄主和非寄主病原EF-Tu蛋白,并能有效地誘導防御反應[2]。某些非寄主病原能通過分泌效應蛋白到植物體內,從而突破PTI的防御,然而植物進化出監視機制,能夠感知或識別效應蛋白,從而導致效應蛋白引發的免疫反應(effector-triggered immunity,ETI)[20]。擬南芥和蘿卜能通過識別III型分泌系統依賴的非寄主病原P.syringaepv.tomatoT1的效應蛋白hopAS1,而效應蛋白突變后導致非寄主病原P.syringaepv.tomatoT1具有對擬南芥的致病力[3]。

2 抗病基因介導的抗病性

R基因與防御相關基因都是在植物抗病過程中起作用的基因。植物的持久抗病性可由單個或少數幾個主效基因控制,抗病性表現為質量性狀,有的則由多個微效基因控制,抗病性表現為數量性狀。適應性病原進化出效應蛋白來抑制或逃避植物的先天免疫反應,從而實現對寄主植物的成功侵染。大麗輪枝菌Verticilliumdahliae能合成糖苷水解酶GH12家族蛋白VdEG1和VdEG3,前者與跨膜受體蛋白復合體(LRR-RLPs/SOBIR1/BAK1)互作誘導免疫反應;而后者與跨膜受體激酶復合體(LRR-RLKs/BAK1)互作誘導免疫反應[21]。大豆通過質外體葡聚糖酶抑制蛋白(glucanase inhibitor protein,GmGIP1)結合到PsXEG1上,抑制其活性,而大豆疫霉菌P.sojae分泌的PsXEG1同源失活誘餌蛋白PsXLP1具有更強的GmGIP1結合活性,從而保證了PsXEG1發揮毒力作用,P.sojae同時分泌的RXLR效應因子也能干擾植物PTI過程[22]。因此,病原菌也進化形成了逃避寄主抗病基因監控的能力。

核苷酸結合位點-富含亮氨酸重復區(nucleotide-binding site-leucine-rich repeat,NBS-LRR)蛋白是R蛋白的重要成員,多個已克隆定位的NBS-LRR基因被鑒定為廣譜抗性基因。植物NBS-LRR蛋白主要包含碳端LRR、氮端TIR/CC和中間的NBS等3個功能域[23]。NBS特異性結合和水解ATP[24],主要控制信號轉導,LRR結構域參與蛋白質與蛋白質互作和病原體的識別,決定了抗性的特異性[25]。水稻中已鑒定8個NBS-LRR基因,均具有稻瘟病抗性[5],具有CC-NB-LRR結構的非典型R基因(Pb1)和5個R基因(Pi36、Pib、Pita、Pit和Piz-t)均可通過CC功能域作用于WRKY45和WRKY66,介導了持久性抗病[26]。有些抗病基因需要2個NBS-LRR基因共同介導對稻瘟病的抗性,任何一個基因的缺少或突變都影響抗病性的實現,如擬南芥中RPP2A和RPP2B同時介導的對霜霉菌的小種專化抗性[27]、水稻中Pikm1TS和Pikm2TS介導的Pikm抗性[28]、Pi5-1和Pi5-2介導的Pi5抗性[29]、Pikp-1和Pikp-2介導的Pikp抗性[30]、RRS1和RPS4介導的對多種細菌性病害的抗性[31]等。兩個抗性蛋白結合形成“抗性復合體”,或者其中一個抗病蛋白是另一個發揮作用的誘導蛋白或下游抗病蛋白[23]。

作物病害數量抗性由多基因或數量性狀位點(quantitative trait loci,QTL)控制,具有廣譜性和持久性特點[32]。防衛相關基因在數量抗病中通過抵御病原菌生長和擴展發揮作用,防衛基因的過量表達可以增強植株的抗病能力[33]。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯反應是植物重要的基礎免疫[34]。MPK6正調控水稻對白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)的局部抗性,負調控對Xoo的系統獲得抗性[35-36]。水稻8號染色體上存在由多個類萌發素蛋白基因組成的主效抗稻瘟病QTL,抑制這些基因表達會降低水稻對稻瘟病的抗性[37]。萵苣中發現15個QTLs在植株發育的整個或部分階段保持對白粉病的抗性[4]。WRKY13和WRKY45屬于WRKY型轉錄因子,在水稻病原互作中調控了一系列防衛相關基因的表達[38-39]。除此之外,NH1、TGA2.1對Xoo的防御,OsRac1、OsAOS2對稻瘟病菌的防御都屬于數量抗病性作用[40]。有些數量抗病基因的等位基因具有完全相反的功能,如水稻中抗病和感病pi21編碼了不同的蛋白,導致其在水稻與稻瘟病菌互作中發揮不同的功能[41],兩個GH3-2等位基因編碼完全相同的蛋白,但是其啟動子區不同,導致其誘導效率不同[42]。然而,R基因介導的抗性與QTLs抗性并不能完全區分開,大量研究顯示,稻瘟病抗性QTLs的定位大多與R基因臨近,可能與R基因的調節有關[43]。部分抗性基因Pi34的抗性也決定于AvrPi34,說明有些部分抗性也符合基因對基因假說[43]。

3 miRNA相關的抗病性

miRNA是一類長度約為20～24個核苷酸的非編碼的單鏈RNA。miRNA在轉錄后水平調控基因表達,參與形成RNA誘導的沉默復合體,調控抑制靶基因翻譯或mRNA降解[44],參與生物體的生長發育和脅迫抗性過程[8,45-46]。miRNA在植物的PTI和ETI免疫過程中均發揮重要作用。同時,病原體進化出效應蛋白來抑制或劫持寄主的miRNA通路,這導致了植物和病原體在miRNA介導的防御水平上形成軍備競賽[8]。miRNA在植物R基因表達中發揮重要的調控作用,這種機制在多個物種中具有保守性,在植物的抗病、雜交、自身免疫和適應性方面起著至關重要的作用[47]。研究表明,csi-miR167和csi-miR396影響了柑橘離子轉運和防御反應[48]。miR393與至少3個生長素受體F-box蛋白發生作用,是植物生長素信號和PTI響應的連接分子,持續表達miR393a的植物對細菌性病原PtoDC3000敏感性降低[8]。miR393通過調節水楊酸(salicylic acid,SA)—生長素(auxin)之間的動態平衡向SA偏移,改變次級代謝流,利用調節病程相關基因的胞吐作用等方式增強了植物的抗病性[8]。在番茄、馬鈴薯和煙草中至少搜索到10個miRNA家族及其靶基因,說明植物基因組中普遍存在miRNA調節R基因表達的現象[48]。番茄miR482能與58個R基因發生作用,尤其偏好CC-NBS-LRR型的mRNAs[49]。煙草nta-miR6019和nta-miR6020作用于TIR-NBS-LRR蛋白[48]。miR2118能調節抗病蛋白TIR-NBS-LRR的積累,黃萎病菌Verticilliumdahliae侵染的棉花根中miR2118下調表達,其靶蛋白大量積累,提高了植物根部的防御能力[50]。接種楊樹潰瘍病菌Dothiorellagregaria后,植物miR1447表達增加,而miR1448和miR472表達則降低,三者均能作用于抗病蛋白[51]。也有報道大麗輪枝菌侵染后,棉花miR166和miR159表達上調,引起真菌菌絲特異性沉默,同時發現真菌毒力基因Clp-1和HiC-15能被棉花miRNA識別并降解[52]。

4 感病基因與抗病性

植物中能夠促進病原侵染和有利于親和互作的基因均可定義為感病基因(susceptibility gene,S gene)。PMR6是感白粉病擬南芥中一個關鍵基因,該基因缺失突變體表現出對白粉病的抗性,這種親和互作所需基因的功能丟失揭示了植物另一種抗病新策略[53]。隨后S基因的概念于2002年被提出[54]。根據寄主-病原菌互作的進程,S基因主要通過以下機制促進植物感病和病原侵染:1)促進侵入前親和互作,包括寄主對病原的識別和病原的侵入;2)編碼免疫信號的負調控因子;3)促進侵入后親和互作,包括提供病原代謝和結構方面的營養需求,促進病原增殖等[55]。S基因突變或缺失導致植物抗病性增強,最終限制了病原菌的致病能力[55]。

植物為病原提供生長發育必需的成分而促進了其入侵,合成這些促進感病成分的植物基因也屬于S基因范疇。如苜蓿irg1突變體通過降低葉片表面蠟上的原醇減少了兩種銹病病原菌Phakopsorapachyrhizi、Pucciniaemaculata和炭疽病病原菌Colletotrichumtrifolii的分化[56],苜蓿ram2突變體通過改變葉片角質成分使其對棕櫚疫霉Phytophthorapalmivora的敏感性降低[57]。膨脹素是引起細胞壁疏松并促進細胞生長的因子,膨脹素EXLA2卻是灰霉病和黑斑病親和性的必需因子,其能夠促進病原侵入[58]。胼胝質合成相關基因PMR4突變導致防御基因表達增強和感病性下降,番茄中PMR4的沉默也提高了植株對白粉病菌Oidiumneolycopersici的抗性,表明PMR4是白粉病保守的S基因[7]。植物抗病反應的負調控因子也屬于S基因。植物中MAPK信號會增強PTI,而MKPs通過磷酸化作用抑制MAPK活性,mkp突變體對毒性細菌Ralstoniasolanacearum和P.syringae感病性下降[59-60]。但是也有些MAPK級聯反應抑制PTI,如大豆MPK4和水稻MAPK5抑制PTI或SA防御活性,突變體對卵菌和病毒、真菌和細菌病原感病性下降[61-62]。因此,根據通路不同,MAPK和MKP均可歸于S基因。轉錄因子在病原感知的轉錄再編程中起重要的作用,對植物的抗病過程具有正或負調控的功能。水稻WRKY45-1為X.oryzae的感病因子,其同源蛋白WRKY45-2卻是抗病因子[39]。

植物為了維持正常的生命活動,在沒有病原或病原信號解除后需要及時恢復正常的生命進程。這些先天免疫抑制相關基因也屬于S基因范疇。LecRK、RIN4和H+ATPase AHA1共同調控了氣孔的張開,尤其負調控病原誘導的氣孔關閉,使突變體對細菌病原的侵入敏感性降低[63]。SA是活體寄生病原防御信號分子,擬南芥水楊酸-3-羥化酶(S3H)能將SA轉化為2,3-DHBA,s3h突變體對丁香假單胞菌敏感性降低,說明S3H會提高植株的感病性[64]。纖維素合成酶是植物細胞壁構成的重要酶類,纖維素合酶基因CESA3、CESA4、CESA7、CESA8均與植物的感病性有關,突變體均增加了對真菌和細菌病原的抗性[9]。類纖維素合成基因CSLA9是農桿菌介導轉化所必需的,其突變體根系表面農桿菌顯著減少[65]。植物病原在與植物的協調進化過程中發展出效應蛋白來突破植物的免疫系統,病原菌能產生數百種效應蛋白,這些效應蛋白通過抑制寄主抗性因子或活化S基因編碼的感病因子,突破植物的防御網絡而獲取營養。

5 植物抗病性在育種中的應用

5.1 非寄主抗性

非寄主抗性作為廣譜、高效、持久的植物抗性,在作物品種改良與分子育種中有重要的應用價值。然而與寄主抗性相比,非寄主抗性往往屬于多基因控制,有多種組分參與抗病性,其具體作用機制還不清晰,其分子操作性較差,分子育種存在諸多困難。雖然很少但仍有一些成功的例子,通過雜交技術實現了非寄主抗性基因在親緣關系較近的物種間進行轉基因操作。擬南芥EFR轉基因到煙草和番茄中,顯著提高了植物對寄主病原的抗性[2]。通過將系統獲得抗性相關的擬南芥NPR1轉入二倍體草莓中,增強了其對炭疽病、白粉病、細菌角斑病的抗性[66]。AtNPR1在柑橘黃龍病的控制中也已獲得有效的應用[67]。隨著高通量測序技術的發展,越來越多的植物和病原特征基因組被揭示,將會有更多的非寄主抗性基因被發掘和應用在遺傳育種中。利用非寄主抗性培育廣譜而持久抗性的植物新品種將成為遺傳育種的新途徑。

5.2 抗病基因

通過轉基因或過表達NBS-LRR基因顯著提高了植物的抗病性。過表達花生NBS-LRR基因AhRRS5,顯著增強了煙草對青枯病的抗病性[68]。然而,植物NBS-LRR防御基因的高表達對植物細胞是不利的,容易導致能量損耗而影響植物生長,植物實施多種機制控制NBS-LRR防御基因的轉錄水平,進化出microRNA-NBS-LRR系統來調控NBS-LRR的表達[69]。目前,許多植物中NBS-LRR基因已被克隆并進行深入研究[70],然而仍然有很多問題并不清楚。NBS-LRR蛋白不同結構域與病原的效應蛋白是如何相互作用的？在親和與非親和互作中NBS-LRR蛋白起作用的差異是什么？這些問題的解決對NBS-LRR基因的開發利用具有重要的意義。

水稻的數量抗病性基因研究和應用取得了較大進展,但在具體應用中也存在一些問題。Fukuoka等[71]將4個獨立的水稻QTL進行不同組合后,導入不同統一遺傳背景水稻中,發現多個不同的QTL組合比單獨的單個QTL提供更高的抗性水平,而且在給定的遺傳背景中抗性QTL的數量與抗性水平呈正相關。通過標記輔助選擇技術將玉米絲黑穗病的dQTL(disease QTL)抗性等位基因qHSR1導入10個感病自交系,其對絲黑穗病的抗性均有顯著提高,其余農藝性狀基本保持不變[72]。大片段的基因導入可能會導致遺傳連鎖累贅或多效性,識別潛在的有效dQTL最小導入片段是較好的策略,數量抗性基因的鑒定是深入了解QDR分子機制的首要步驟。隨著越來越多植物的全基因組被測序,SNPs的高通量基因分型平臺的商業化應用,以及全基因組測序在育種上的應用,將會有越來越多的具有廣譜而持久抗性的植物品系被開發出來。

5.3 miRNA

miRNA在植物抗病中發揮重要作用,通過對miRNA的調控可以實現植物抗病性的提高,利用miRNA提高作物的抗病性是病害防治的重要策略。近年來,關于不同病原互作系統中miRNA的了解越來越清晰,在植物抗病育種中也有一些成功的應用,過表達Osa-mir7695植株增強了水稻對稻瘟病的抗性[6]。然而,不同植物中不同的病原真菌誘導的相同miRNA的表達不同,這可能與植物的遺傳、生長階段以及R基因的存在與否有關,因此,僅僅研究miRNA及其靶基因的表達很難了解植物抗病的明確機制,通過反向遺傳學方法,對單個miRNA及其靶基因在抗病遺傳育種中的有效應用,將成為今后研究的重點。通過改變靶基因核苷酸序列,使之轉錄物不能被miRNA結合或降解,也是值得關注的研究內容[7]。

5.4 感病基因

S基因突變能提高植物抗病性而成為作物遺傳育種的目標。大麥中顯性基因MLO(MildewLocusO)突變后產生對白粉病的持久、廣譜抗性。MLO作為S基因在擬南芥、豌豆、番茄、辣椒、小麥和草莓等植物中被確認,突變體一直被生產中用作抗白粉病品系[73-74]。使用CRISPR編輯技術對鄧肯葡萄柚感病基因CsLOB1進行編輯,增強了植物對柑橘黃龍病菌的抗性[75]。茄子中MLO同源基因SmMLO1的突變體也增強了對白粉病的抗性[76]。因此,S基因突變在培育廣譜而持久抗性品系中具有很好的應用前景。S基因是病原菌-寄主間親和互作的決定因子,在遺傳育種中具有巨大的應用價值,然而S基因往往還參與了植物的其他進程,因此需要通過單基因突變來研究其具體功能。但是S基因的難操作性以及功能的多效性導致遺傳育種還存在以下難點:1)S基因如果屬于多成員家族,其在遺傳育種中應用的可行性如何;2)S基因突變品系能否具有足夠高效的抗病性;3)S基因突變抗病品系是否具有嚴重的缺陷,如產量下降、品質降低、其他脅迫耐受性下降等。雖然S基因的應用存在諸多困難,毋庸置疑,隨著基因組編輯技術和轉基因技術的發展,S基因應用的前景必將越來越廣闊。

5.5 基因組編輯技術

基因組編輯技術(genome editing)通過基因組水平上簡單、精確的遺傳操作,實現植物遺傳改良,在植物抗病和抗逆遺傳育種中具有重要應用價值。當前,應用較多的植物基因組編輯技術主要為鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇的規律間隔的短回文重復序列及其相關系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas system)[77]。高彩霞研究團隊利用TALEN和CRISPR/Cas9技術對六倍體普通小麥TaMLO同源等位基因進行編輯,增強了小麥對白粉病菌的廣譜抗性[78],利用CRISPR/Cas9技術同時突變了小麥基因組中的3個蛋白激酶EDR1同源基因,也增強了小麥對白粉菌的抗性水平[79]。通過CRISPR/Cas9 DNA或RNA瞬時表達,對六倍體小麥及四倍體小麥的7個不同基因進行了定點敲除,獲得了具有穩定遺傳能力的突變材料[80]。雖然基因組編輯技術在作物遺傳改良上的應用才剛剛起步,鑒于其具有的其他分子技術無法比擬的巨大優勢,該技術必將成為未來作物遺傳改良的核心技術之一。