南瓜育種相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)展

鄭 揚(yáng) 張國(guó)裕 張 帆 田佳星 張沙沙， 王建書 李海真*

〔1北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北邯鄲 056038〕

南瓜（Cucurbitaspp.）是世界范圍內(nèi)栽培的重要瓜類蔬菜。我國(guó)是南瓜生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，播種面積和產(chǎn)量均居世界前列，2016年我國(guó)南瓜栽培面積42.28萬hm2，產(chǎn)量778.94萬t，分別占世界總量的21.6%和29.4%（FAO，F(xiàn)AO-Statistics.www.fao.org/）。南瓜易于管理、種植效益好，是農(nóng)民增收、農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要支柱，種植面積呈遞增趨勢(shì)。但南瓜遺傳育種相關(guān)基礎(chǔ)研究起步較晚，遠(yuǎn)落后于葫蘆科其他主要瓜類蔬菜，限制了育種技術(shù)的提升與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。近年來，在科技工作者的努力下南瓜基礎(chǔ)研究取得了一些突破性成果。本文從基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、遺傳圖譜構(gòu)建與基因/QTLs定位、種質(zhì)遺傳多樣性分析、分子育種等方面進(jìn)行研究進(jìn)展概述，并對(duì)面臨的問題及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，旨在為南瓜育種及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 南瓜基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2017年以來南瓜重要的3個(gè)栽培種，印度南瓜（C. maxima）、中國(guó)南瓜（C. moschata）與西葫蘆（C. pepo）全基因組從頭測(cè)序工作完成并先后釋放（Sun et al.，2017；Montero-Pau et al.，2018），組裝后基因組大小分別為271.4、269.9 Mb和263.0 Mb，各自包含32 076、32 205個(gè)和34 240個(gè)基因，標(biāo)志著南瓜遺傳育種與分子生物學(xué)研究跨入新的時(shí)代，有了高質(zhì)量參考基因組工具。同時(shí)，基因組測(cè)序還揭示了南瓜異源四倍化事件，并推測(cè)葫蘆科內(nèi)屬的分化發(fā)生在3 000萬年前。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析了南瓜種間雜種的基因表達(dá)變化對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的貢獻(xiàn)。這些研究結(jié)果為多倍體基因組進(jìn)化模型研究和雜交種親本的選配提供了理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在南瓜上得到了快速應(yīng)用，除獲得海量序列信息與分子標(biāo)記外（Wu et al.，2014；王洋洋 等，2016；朱海生 等，2018），也鑒別了一些重要性狀或生物過程相關(guān)基因。Blanca等（2011）首次開展西葫蘆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒別參與抗病、開花與果實(shí)品質(zhì)形成相關(guān)的基因，獲得大量SSR與SNP標(biāo)記。翌年，Esteras等（2012）利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建了西葫蘆第1張高密度遺傳圖譜，并對(duì)開花、果實(shí)形狀和顏色等性狀進(jìn)行了QTL分析。Wyatt等（2015，2016）利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定了參與西葫蘆類胡蘿卜素和碳水化合物代謝的關(guān)鍵基因，并認(rèn)為這些基因的表達(dá)調(diào)控是影響果實(shí)品質(zhì)的主要因素。王安君等（2016）也開展了中國(guó)南瓜與印度南瓜果實(shí)中糖、淀粉、類胡蘿卜素和肌醇形成相關(guān)差異表達(dá)基因的研究。一些參與花形成、低溫脅迫、果實(shí)大小與形狀發(fā)育、蚜蟲吸食防御反應(yīng)及白粉病誘導(dǎo)的基因也在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行了挖掘鑒定（Guo et al.，2008； 鐘 玉 娟 等，2015；Xanthopoulou et al.，2015；Vitiello et al.，2016）。

2 遺傳圖譜構(gòu)建及重要基因/QTLs定位

遺傳圖譜構(gòu)建及重要基因/QTLs定位是分子育種的基礎(chǔ)。早期，利用同工酶、RAPD與AFLP標(biāo)記構(gòu)建南瓜遺傳圖譜，獲得與黃果皮基因B、白斑病基因M、裸仁基因n和小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）抗病基因等連鎖的標(biāo)記，但圖譜標(biāo)記稀少，性狀與標(biāo)記連鎖不緊密，標(biāo)記檢測(cè)過程繁瑣或穩(wěn)定性差（Weeden＆Robinson，1986；Lee et al.，1995；Brown ＆ Myers，2002；Zraidi＆ Lelley，2004；Zraidi et al.，2007；陳鳳珍，2008）。Gong 等（2008a，2008b）開發(fā)了大量擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR標(biāo)記，先后構(gòu)建了西葫蘆與中國(guó)南瓜遺傳圖譜，并揭示了兩者基因組間的線性關(guān)系。向成鋼（2013）與Ge等（2015）分別構(gòu)建了包含SSR 標(biāo)記的印度南瓜遺傳圖譜，獲得與全綠基因gf和瓜皮色基因Rc遺傳距離6.3 cM和5.9 cM的SSR標(biāo)記；南瓜粒寬與耐冷性狀也在構(gòu)建遺傳圖譜后進(jìn)行了QTL定位（譚行之 等，2013；Xu et al.，2017）。

高通量測(cè)序技術(shù)為SSR與SNP標(biāo)記的大量開發(fā)及高密度遺傳圖譜的構(gòu)建帶來了契機(jī)（Esteras et al.，2012）。Zhang等（2015）構(gòu)建了印度南瓜第1張包含458 個(gè)SNPs標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，鑒定了短蔓候選基因Cma_004516。針對(duì)果肉淀粉含量、種子粒長(zhǎng)、粒寬等性狀也進(jìn)行了QTL分析（毛曉微，2016）。Montero-Pau等（2017）構(gòu)建了包含7 718個(gè)SNPs標(biāo)記的西葫蘆連鎖圖，獲得與開花、果實(shí)品質(zhì)等性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)48個(gè)。Zhong等（2017）構(gòu)建了包含3 470個(gè)SNPs標(biāo)記的中國(guó)南瓜遺傳圖譜，將瓜皮色與條紋基因定位在第8連鎖群0.31 cM的區(qū)域內(nèi)，獲得與果實(shí)類胡蘿卜素與糖含量、瓜瘤、瓜直徑等12個(gè)性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)29個(gè)。Ka?m iń ska等（2018）構(gòu)建了包含1 824個(gè)標(biāo)記的印度南瓜遺傳圖譜，獲得3個(gè)控制果肉顏色和類胡蘿卜素含量的QTL位點(diǎn)。

另外，趙福寬等（2007）在南瓜上獲得與黃瓜花葉病毒（CMV）抗病基因遺傳距離為7.1 cM的RAPD標(biāo)記。李云龍等（2007）獲得與中國(guó)南瓜短蔓基因遺傳距離為2.9 cM的SCAR標(biāo)記，王深浩等（2011）進(jìn)一步將連鎖標(biāo)記縮近到1.0 cM。Kabelka和Young（2011）獲得與西葫蘆銀葉病抗病基因（sl）遺傳距離3.3 cM 的SSR標(biāo)記。李智媛等（2011）獲得與西葫蘆裸仁性狀連鎖的SCAR標(biāo)記。高旭（2014）鑒定了與南瓜耐鹽、耐澇性狀連鎖的RAPD和SSR標(biāo)記。Pachner等（2015）獲得3個(gè)與籽油用西葫蘆ZYMV抗病基因連鎖的SSR與SCAR標(biāo)記，Capuozzo等（2017）獲得連鎖更為緊密的SNP標(biāo)記。Kim等（2016）在中國(guó)南瓜上開發(fā)了與西瓜花葉病毒（WMV）、ZYMV抗性連鎖的4個(gè)RAPD標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化成功1個(gè)SCAR標(biāo)記。Holdsworth等（2016）將南瓜白粉病抗病基因定位在76.4 kb的區(qū)間內(nèi)。單文琪（2016）獲得與印度南瓜強(qiáng)雌性狀連鎖的分子標(biāo)記，李海真團(tuán)隊(duì)也將該性狀定位在57.4 kb的區(qū)域內(nèi)（孫劍飛，2018）。周洋洋等（2018）獲得與瓜皮色遺傳距離1.86 cM（145.13 kb）的SNP分子標(biāo)記，并開發(fā)了2個(gè)dCAPS標(biāo)記。

3 分子標(biāo)記輔助選擇育種

與南瓜重要性狀連鎖緊密的分子標(biāo)記較少，且早期多為RAPD或AFLP標(biāo)記，操作復(fù)雜或擴(kuò)增穩(wěn)定性差，應(yīng)用困難，加之育種單位間技術(shù)發(fā)展不平衡，真正開展分子標(biāo)記輔助選擇育種的單位較少。Lelley和Henglmuller（2000）利用分子標(biāo)記進(jìn)行籽油用西葫蘆ZYMV抗病育種。2010年左右先正達(dá)將與抗病基因連鎖的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SNP標(biāo)記，最早開展KASP高通量標(biāo)記輔助選擇育種，篩查南瓜白粉病與ZYMV病毒病抗性單株。稍后，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心李海真團(tuán)隊(duì)也利用自主研發(fā)的SSR標(biāo)記開展白粉病與病毒病抗性育種（李海真 等，2014），并逐步將短蔓、強(qiáng)雌與南瓜類砧木脫蠟粉等性狀納入分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)體系。Pachner等（2015）也利用SCAR和SSR標(biāo)記進(jìn)行籽油用西葫蘆ZYMV抗病篩查轉(zhuǎn)育。

4 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性研究可以揭示不同種質(zhì)材料間的遺傳變異程度，為種質(zhì)資源的科學(xué)分類及育種選擇提供依據(jù)。早期利用同工酶、RAPD標(biāo)記、細(xì)胞器DNA揭示南瓜3個(gè)主要栽培種中，中國(guó)南瓜遺傳多樣性與西葫蘆相似，高于印度南瓜（Jobst et al.，1998；Baranek et al.，2000）。Paris等（2003）利用分子標(biāo)記將45份西葫蘆材料分成3個(gè)類群（pepo、ovifera和fraterna），并揭示后兩者親緣關(guān)系更近，且栽培種內(nèi)具有豐富的遺傳變異。后來，Gong等（2012）也將100份西葫蘆材料分成這3個(gè)類群，并推測(cè)聚類在2個(gè)栽培種間的4份材料為未被馴化 的 野 生 種。Ferriol等（2003a）、Formisano等（2012）分別利用SRAP、AFLP和EST-SSR標(biāo)記將西班牙的69份南瓜商品種和地方品種分為2個(gè)亞類pepo和ovifera，認(rèn)為地方品種中存在的豐富有利遺傳變異未被廣泛利用。希臘與南非的西葫蘆地方品種也利用分子標(biāo)記進(jìn)行了多樣性分析（Ntuli et al.，2015；Xanthopoulou et al.，2015）。利用RAPD和SBAP標(biāo)記，F(xiàn)erriol等（2003b）將西班牙的印度南瓜地方品種也分為了3個(gè)類群。Ka?m iń ska等（2017）利用SSR標(biāo)記對(duì)85份來源于不同國(guó)家的印度南瓜種質(zhì)材料進(jìn)行了多樣性分析。Kong等（2014）報(bào)道砧用南瓜商品種多為印度南瓜與中國(guó)南瓜種間雜交種，且砧用中國(guó)南瓜自交系間存在可利用的高遺傳變異。Gwanama 等（2000）將非洲中南部31份中國(guó)南瓜地方品種劃分為4個(gè)類群。Barboza等（2012）分析了中美洲地區(qū)的218份中國(guó)南瓜，認(rèn)為來源于墨西哥的材料較來源于尼加拉瓜、危地馬拉和巴拿馬的材料多樣性更為豐富。

國(guó)內(nèi)，Wu等（2011）采用AFLP標(biāo)記對(duì)74份來源于中國(guó)、15份來源于其他國(guó)家的中國(guó)南瓜進(jìn)行分析，來源于中國(guó)的材料被分為2類，與印度和日本的資源相近，明顯有別于墨西哥、危地馬拉、洪都拉斯和厄瓜多爾的資源。李俊麗等（2005）與盧麗芳等（2015）均利用分子標(biāo)記將南瓜材料分成中國(guó)南瓜、印度南瓜與西葫蘆3大類群。云天海等（2013）應(yīng)用ISSR和SRAP標(biāo)記對(duì)28 份海南南瓜農(nóng)家品種的遺傳特異性進(jìn)行分析，構(gòu)建了指紋圖譜。王瑞等（2016）利用SSR標(biāo)記將95份南瓜材料分成3個(gè)類群；王迎兒等（2017）將浙江省41份南瓜材料分成4個(gè)類群。另外，南瓜豐富的表型變異特征也被用以種質(zhì)遺傳多樣性研究（Tsivelikas et al.，2009；Balkaya et al.，2010； 楊 正 安 等，2011；屈淑平 等，2013；李鶴 等，2014；郁永明 等，2014；鄭道君 等，2016；Darrudi et al.，2018）。

5 轉(zhuǎn)基因育種

針對(duì)病毒病的嚴(yán)重危害，美國(guó)1995年釋放了第1個(gè)轉(zhuǎn)ZYMV外殼蛋白基因的西葫蘆抗病品種，翌年又釋放了可以同時(shí)抵御ZYMV、WMV和CMV 3種病毒侵害的轉(zhuǎn)基因西葫蘆品種（Fuchs &Gonsalves，1995；Tricoli et al.，1995；Fuchs et al.，1998），后又培育出抗南瓜花葉病毒（SqMV）的轉(zhuǎn)基因西葫蘆品種（Provvidenti＆ Tricoli，2002）。Shah等（2008）以西葫蘆莖尖為外植體，同時(shí)轉(zhuǎn)化2個(gè)載體，轉(zhuǎn)化效率為0.7%。Nanasato等（2011，2013）以中國(guó)南瓜子葉節(jié)為受體，初始獲得2.7%遺傳轉(zhuǎn)化效率，后來提高到9.2%，而西葫蘆、印度南瓜與黑籽南瓜的轉(zhuǎn)化效率較低，僅為 0.2%～0.3%， 但 Ram í rez-Ortega等（2015） 卻在印度南瓜上獲得17.6%～56.0%的高轉(zhuǎn)化率。國(guó)內(nèi)在南瓜轉(zhuǎn)基因方面也進(jìn)行了不斷探索。王晶晶等（2007）成功將菜豆幾丁質(zhì)酶基因經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入南瓜中。李長(zhǎng)生等（2009）對(duì)黑籽南瓜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的適宜條件進(jìn)行了研究。付洪冰等（2010）利用根瘤農(nóng)桿菌侵染南瓜子葉節(jié)，成功獲得轉(zhuǎn)化率為0.56%的陽性植株。張言朝等（2012）利用子房注射法獲得轉(zhuǎn)化aiiA基因的陽性株，轉(zhuǎn)化率為 0.25%。

6 單倍體育種

雙單倍體技術(shù)可以顯著提高優(yōu)良株系純化速度，提高育種效率。Chambonnet＆Dumas（1985）培養(yǎng)西葫蘆未受精胚珠，獲得單倍體與二倍體的嵌合植株。隨后，Metwally等（1998）探索了低溫預(yù)冷（4 ℃）和培養(yǎng)基處理對(duì)開花前1 d胚珠培養(yǎng)的影響，獲得西葫蘆單倍體和雙單倍體植株。同年，Metwally等利用花藥培養(yǎng)也獲得西葫蘆單倍體植株。Shalaby（2007）培養(yǎng)西葫蘆子房切片，再生植株中35%為單倍體，剩余為雙單倍體。Kurtar等（2018）對(duì)印度南瓜和中國(guó)南瓜進(jìn)行大孢子培養(yǎng)，可獲得37.7%的雙單倍體誘導(dǎo)率。國(guó)內(nèi)很多學(xué)者也對(duì)大孢子培養(yǎng)獲得單倍體的條件進(jìn)行了探索，并得到西葫蘆（陳學(xué)軍 等，2000；郭永強(qiáng) 等，2004；謝冰 等，2006；徐靜，2007；劉栓桃 等，2008；葛志東，2009）與中國(guó)南瓜（翟慶慧，2009；孫守如 等，2013；閔子揚(yáng) 等，2016）單倍體植株。另外，Kurtar等（2002）、Kurtar和 Balkaya（2010）利用輻射花粉誘導(dǎo)途徑獲得西葫蘆單倍體，誘導(dǎo)率為幼胚的1.17%，Ko?mrlj等（2013）也獲得類似結(jié)果。國(guó)內(nèi)，許利彩等（2009）和蘇敏等（2011）利用輻射花粉誘導(dǎo)西葫蘆單倍體，獲得5.08%～7.40%的誘導(dǎo)率。單倍體誘導(dǎo)效率及穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高，同時(shí)受體材料基因型間的差異也需克服。

7 存在問題及展望

目前我國(guó)南瓜育種基礎(chǔ)研究面臨的主要問題有：研究起步晚，長(zhǎng)期投入少，研究深度不夠，創(chuàng)新性不足；各單位發(fā)展不平衡，基礎(chǔ)研究帶來的新技術(shù)、新方法在育種上應(yīng)用少，對(duì)育成品種的貢獻(xiàn)率低，還沒有起到引領(lǐng)推動(dòng)南瓜育種技術(shù)提升及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用。因此，今后應(yīng)該在以下幾個(gè)方面做出努力：

① 加強(qiáng)基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的利用。南瓜組學(xué)研究還處于發(fā)展初期，海量研究數(shù)據(jù)會(huì)不斷涌現(xiàn)，深入開展比較基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組研究，在基因組水平對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行深入鑒定及對(duì)重要功能基因進(jìn)行快速發(fā)掘，為新品種選育提供指導(dǎo)。

② 加快分子設(shè)計(jì)育種體系建設(shè)，創(chuàng)制突破性南瓜新品種。在重要性狀控制基因不斷發(fā)掘的基礎(chǔ)上加強(qiáng)應(yīng)用平臺(tái)建設(shè)，實(shí)現(xiàn)分子育種與常規(guī)育種技術(shù)的緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的最佳配置，提高多目標(biāo)性狀同步改良的效率，將傳統(tǒng)育種逐步向現(xiàn)代分子育種轉(zhuǎn)變，提升我國(guó)南瓜育種技術(shù)水平，增強(qiáng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，以種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種培育為突破口，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保證。

③ 爭(zhēng)取在單倍體育種與轉(zhuǎn)基因育種上有所突破。克服目前南瓜雙單倍體誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因效率低的問題，實(shí)現(xiàn)雙單倍體育種應(yīng)用，提高優(yōu)良株系純合速度；提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，做好基因工程育種包括基因編輯系統(tǒng)的技術(shù)儲(chǔ)備研究。