耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥機制和危險因素研究進展

陶慧婷，楊旭

（昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，昆明650101）

腸桿菌科細菌是棲居在人和動物腸道內(nèi)的一群形態(tài)、生物學形狀相似的革蘭陰性桿菌，在自然界廣泛分布，以人腸道菌群為主。其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌，易在胃腸道、生殖道等部位定植，當人體免疫功能下降時則可能會導致感染。近年來，由于抗生素等藥物的不合理使用使耐藥株迅速增長，并以多重耐藥為顯著特點［1］。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的首選藥物，但隨著此類藥物的大量使用，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE），直接導致患者住院時間的延長，預后差，發(fā)病率和死亡率的日益升高。2016年中國細菌耐藥網(wǎng)（CHINET）發(fā)布監(jiān)測報告提示臨床分離菌對常用抗菌藥物的耐藥率仍呈增長趨勢［2］，對耐藥菌的檢測篩查和管理仍然為重中之重。

1 耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的耐藥機制

CRE菌株常見耐藥機制有4種：①CRE菌株產(chǎn)碳青霉烯酶；②菌株外膜蛋白表達缺失伴產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC）；③抗菌藥物作用靶位改變；④菌株外排泵高表達。有研究提出所有CRE菌株中約50%為產(chǎn)碳青霉烯酶類的耐藥菌［3］，其次為孔蛋白表達缺失伴產(chǎn) ESBLs和AmpC，而抗菌藥物靶位改變和外排泵高表達則較少報道。

1.1 產(chǎn)碳青霉烯酶 碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶，按 Amber分類可分為三大類：A類，B類和D類。A類和D類為絲氨酸酶，即需要絲氨酸作為其活性位點，而B類為金屬酶，需要金屬鋅對β-內(nèi)酰胺酶進行水解。

A類酶包括 KPC，GES，PER，IMI／NMC-A和SME，可以水解所有的β-內(nèi)酰胺酶。A類酶可分為由質(zhì)粒編碼的 KPC和 GES，以及染色體編碼的PER，SME和IMI等兩大類。目前全球范圍內(nèi)流行的主要菌株為 ST258型的克隆株，因其攜帶blaKPC-2或blaKPC-3位于Tn3-Tn4401復合轉座子上，因此具有較強的傳播能力。B類MBLs亦可以水解所有的β-內(nèi)酰胺酶，但對單環(huán)胺類抗生素如氨曲南敏感，可以被金屬螯合劑如EDTA抑制，包括IMP，VIM和NDM。根據(jù)氨基酸序列的同源性可分為3個亞型，臨床工作中常見到的MBLs基本都屬于B1型［4］，而 VIM型和 IMP型的 MBLs通常嵌入Ⅰ類整合子中促進傳播［5］。D類為 OXA酶，由blaOXA等位基因編碼，屬于不動桿菌屬中的酶類，有較強的水解青霉素的能力和稍弱的水解碳青霉烯類抗生素的能力，但由于耐藥菌株中可能表達多種ESBLs，使得其對所有的β內(nèi)酰胺類藥物都有耐藥性。

A、B、D三類酶均可存在于可以水平移動的可移動耐藥元件中，通過接合，轉化，轉導，轉座等方式在不同菌株之間水平傳播，從而導致耐藥菌株的流行。結合各個國家和地區(qū)的研究文獻和相關報道我們得知KPC，OXA-48，VIM和NDM這4種酶可以引起全世界范圍內(nèi)的廣泛傳播，而其他碳青霉烯酶如IMP，GES，PER，SME，SIM等引起的感染則具有相對獨特的地域性。

1.2 細菌孔蛋白表達缺失伴產(chǎn)ESBLs和AmpC ESBLs和AmpC的產(chǎn)生均由質(zhì)粒編碼并常見于腸桿菌科，有學者［6］認為這與誘導型或去抑制型染色體基因酶的高表達有關。孔蛋白屬于革蘭陰性菌外膜上的蛋白質(zhì)，由跨膜蛋白形成孔道，可允許抗菌藥物通過。當其改變或丟失，同時伴 ESBLs和（或）AmpC高產(chǎn)時，可致抗生素在細菌外膜上的擴散速率減緩以至于藥物不能進入細菌內(nèi)部從而產(chǎn)生耐藥性。

較常見的孔蛋白有 OmpK35和 OmpK36等，Laura García-Sureda的研究［7］認為，OmpK35的基因發(fā)生無義突變可導致其早期終止和孔蛋白缺失，而OmpK36的基因突變則可在不同程度上增大藥物的MICs值。Hamzaoui［8］的研究中同樣說明了上述問題。臺灣學者［9］的研究中認為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中OmpK35的缺失更為常見，而OmpK36的缺失可導致厄他培南耐藥率的增加，但對亞胺培南和美羅培南沒有顯著影響。

Omp的缺失加上ESBL和（或）AmpC產(chǎn)生，在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的研究中起重要作用，非產(chǎn)酶類耐碳青霉烯類腸桿菌越來越引起人們的重視，孔蛋白與不同藥物耐藥性之間的關系是近年來的研究熱點，在以后的臨床工作中也可根據(jù)研究結果進行針對性的用藥。

2 耐藥基因的分子流行病學

19世紀80年代中期，人們發(fā)現(xiàn)了碳青霉烯酶，隨后在大腸埃希菌中也發(fā)現(xiàn)了可以水解碳青霉烯類抗生素的酶類，并且在針對耐藥菌的研究中發(fā)現(xiàn)不同耐藥基因及不同地域之間他們的流行與傳播都具有差異性。

2.1 KPC酶 1996年北美一家醫(yī)院的ICU發(fā)現(xiàn)了第一株產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌，2001年美國東北部大量報道了住院患者感染產(chǎn)KPC酶的耐藥菌的案例［10］。可見產(chǎn)KPC酶的耐藥菌在美國的傳播非常明顯和迅速，截至2010年，美國接受調(diào)研的26個醫(yī)療中心共195株腸桿菌科分離株中有28株（14.4%）含blaKPC-2或blaKPC-3，其中三分之一在德克薩斯州被發(fā)現(xiàn)［11］，截至2017年11月，根據(jù)美國CDC網(wǎng)站發(fā)布的結果顯示所有州均有產(chǎn)KPC酶的CRE菌株感染的報道，而這也僅僅只是耐藥菌感染的冰山一角［12］。美國 CDC使用 PFGE和MLST兩種方法分析了1996年至2008年間的耐藥菌株，發(fā)現(xiàn)近70%的耐藥菌都是產(chǎn)KPC酶的ST258型肺炎克雷伯菌［13］，結合其他研究發(fā)現(xiàn)ST258型肺炎克雷伯菌為美國的主要流行株，同時ST258型菌株發(fā)生單位點突變后會形成ST512型和ST11兩種型別，更加促進了blaKPC在全球范圍內(nèi)的傳播。

以色列是繼美國之后第二個報道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌感染的國家。其感染高峰在2007年，經(jīng)過合理監(jiān)管和干預后其傳播率有所下降。但值得注意的是，在2008年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)以色列境內(nèi)所有耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌均攜帶KPC酶，側面反映了KPC酶傳播范圍之廣，傳播之迅速。

自2007年在我國浙江省首次報道產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，耐碳青霉烯類大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐藥率從2004年的0%和0.7%上升到2014年的1.0%和13.4%，中國幾乎所有省市、自治區(qū)都有 CRE的相關報道［14］，Zhang等［15］和 Liu等［16］在2017年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，90%的多重耐藥菌為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，其中產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌占所有耐藥肺炎克雷伯菌的70%，而產(chǎn)KPC-2的大腸埃希菌占所有耐藥大腸埃希菌的40%，可見KPC-2已成為中國境內(nèi)傳播最廣泛的碳青霉烯酶。而與其他國家和地區(qū)不同的是，Zhang等［15］和Liu等［16］的研究中發(fā)現(xiàn)我國流行株為 ST11型肺炎克雷伯菌，在 Samuelsen［17］和 Qi［18］的研究中認為ST11是ST258型肺克發(fā)生了單位點突變而產(chǎn)生的，故兩種型別之間可認為是具有相關性的。

2.2 VIM酶 VIM于1996年和1997年在意大利維羅納和法國馬賽被發(fā)現(xiàn)，分別是VIM-1和VIM-2，VIM-1主要存在于腸桿菌科細菌中，而VIM-2型主要存在非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌中，目前全世界傳播更為廣泛的是VIM-2型，主要由ST147型的肺炎克雷伯菌攜帶傳播，但也有報道認為ST11型肺炎克雷伯菌亦可攜帶 blaVIM［19-20］。Vatopoulos等［21］發(fā)現(xiàn)VIM在意大利的流行導致了肺炎克雷伯菌分離株中近一半對碳青霉烯類抗生素耐藥，同時還有向西班牙等其他國家蔓延的趨勢。總的來說VIM在全球范圍內(nèi)均有疫情報道，至2014年7月共有41種VIM亞型被發(fā)現(xiàn)，我國目前還未發(fā)生VIM的爆發(fā)性感染。

2.3 NDM酶 NDM屬于B類金屬酶類，多見于ST14型的肺炎克雷伯菌攜帶。2008年從一名在印度接受治療的瑞典患者的樣本中檢出，此后NDM在全球范圍內(nèi)迅速傳播，目前發(fā)現(xiàn)的NDM亞型共16種，以NDM-1流行最為廣泛。

印度的NDM的檢出率最高，并以NDM-1最常見，NDM-16次之。印度和巴基斯坦等地區(qū)的報道中發(fā)現(xiàn)NDM檢出率已經(jīng)上升到了13.5%，同時攜帶NDM-1細菌的MLST型別呈現(xiàn)多樣性，已經(jīng)在ST11和ST147型肺炎克雷伯菌以及ST131和ST101型大腸埃希菌在內(nèi)的幾個流行耐藥菌株中均有發(fā)現(xiàn)，還在這些耐藥菌中同時發(fā)現(xiàn)攜帶了其他種類的耐藥基因，使得該耐藥菌表現(xiàn)出多重耐藥性。Chen等［22］的研究中發(fā)現(xiàn)我國攜帶blaNDM的耐藥菌株包括 ST23，ST17，ST76，ST45，側面反映了型別的多樣性。徐茶［23］發(fā)現(xiàn)3株肺炎克雷伯菌MLST分型屬于ST22型，且為同一克隆株，亦與世界范圍內(nèi)主要的流行株不同，同時徐茶等還在一新生兒患者樣本中檢出同時攜帶 NDM-1，TEM-1，fosA3，oqxA和oqxB的ST22型肺炎克雷伯菌，屬國內(nèi)外的首次報道。Zhang等［15］的研究中發(fā)現(xiàn) blaNDM在我國山西，陜西，廣西，江西等地也是主要的流行耐藥基因型。

2.4 OXA酶 OXA屬于D類酶，傳播以OXA-48為主，OXA-181次之，土耳其于2001年在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了OXA-48。較多國家都過OXA引起感染的報道，但關于其流行性則較少提及，這可能是因為OXA酶的水解異質(zhì)性和EDTA及克拉維酸不能抑制而導致的對OXA的流行的不確定性。一些報道中發(fā)現(xiàn)ST11和 ST147型肺炎克雷伯菌在產(chǎn)OXA-48酶的同時還產(chǎn) ESBLs［24］，ST131型大腸埃希菌也被報道同時含blaKPC和blaOXA-48［25］，這也證明了上文中提到的細菌可攜帶多種耐藥基因而表現(xiàn)出的多重耐藥性。

3 CRE感染的危險因素和監(jiān)測方法

CRE是院內(nèi)感染的主要病原菌，感染后的死亡率為可高達50%。研究［12］認為，醫(yī)療環(huán)境中CRE的傳播主要有兩大途徑：①患者之間，醫(yī)患之間相互傳播。如患者之間同處一個病區(qū)，接觸相同的醫(yī)護人員或共享醫(yī)療設備等進行傳播。②CRE菌株在患者體內(nèi)發(fā)生突變，致使遺傳性也發(fā)生了變化。由于其日益上升的發(fā)病率和居高不下的死亡率使得越來越多的學者開始關注CRE感染的危險因素和監(jiān)測方法。

3.1 危險因素 Porwal等［26］認為高齡患者，本身患有基礎疾病及并發(fā)癥的患者和機械通氣為CRE感染的危險因素。Dasgupta等［27］的報道中則提出肺炎是導致耐藥菌感染最常見的疾病（62.07%），其次是尿路感染和中心靜脈導管相關血流感染。同時在針對ICU病房的調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，患者曾經(jīng)接受過抗生素治療，導尿和長期住在ICU病房是感染CRE的危險因素。Salom?o等［28］針對急診科的 CRE定植和感染情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)急診科的CRE定植率為6.8%，患病率為18%，明顯高于其他科室，同時也在沒有危險因素的患者身上發(fā)現(xiàn)了CRE定植。除了既往接受過抗生素治療，他們認為肝臟疾病也是CRE感染的危險因素之一。這可能是因為肝臟疾病患者的免疫力較差，更容易發(fā)生院內(nèi)感染。

結合相關文獻調(diào)查我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)生CRE感染的科室中，急診科、ICU和手術科室是感染的“重災區(qū)”，這可能是由于以上科室的患者大多病情危重，機體免疫力較差，大多會接受抗生素治療，與醫(yī)護人員接觸更加密切等，因而更容易發(fā)生感染。多數(shù)學者都將既往接受過抗生素治療，老齡患者，機械通氣或其他有創(chuàng)支持治療，慢性疾病，曾接受過移植或進行免疫抑制相關治療等列為危險因素。還有研究者提出感染CRE為患者死亡的獨立危險因素，而這也促使我們在平時的工作中將更加關注具有相關危險因素的患者。

3.2 篩查和監(jiān)管 面對CRE感染率的居高不下，我們似乎應該專注于抗菌藥物的研發(fā)，但預防耐藥菌的感染和傳播更加重要。除卻患者本身的因素，加強監(jiān)管也有可待改進的地方。Schwartz-Neiderman等［29］在研究中提出感染CRE的危險因素包括與感染者處于同一病區(qū)大于等于3 d，這提示一旦發(fā)現(xiàn)患者感染CRE，有效的做法是立即隔離，避免發(fā)生院內(nèi)的爆發(fā)性感染，有條件的科室可對同病區(qū)患者進行篩查，防患于未然。在日常診療中盡量縮短住院時間，圍手術期加強管理等也可以減少耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。Grabowski等［30］認為患者感染CRE可能是由于在接受治療時醫(yī)護人員手消不夠嚴格，因此臨床醫(yī)生在接觸患者時需注意無菌操作，避免救治過程中成為細菌傳播的“橋梁”。

對具有危險因素的人員提前預防，持續(xù)監(jiān)測，加強對耐藥菌的監(jiān)管可能是預防傳播過程中較有力的方案。美國CDC建議使用肛周或直腸拭子實行CRE的常規(guī)篩查，對象包括老齡患者，外來人口，長期住院或轉院的患者，接受過移植或長期使用免疫抑制劑的患者等，同時建議對CRE感染者同病區(qū)的患者進行篩查，從傳播源頭進行預防和控制。

我國目前暫無相關條款，但醫(yī)院在預防CRE爆發(fā)性感染方面可以根據(jù)各個地方的流行病學特點加強防范意識，在耐藥菌傳播的高發(fā)科室如ICU，急診科和手術科室等先實行小范圍的篩查。

4 總結

全球范圍內(nèi)仍以產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌為主要傳播菌株，產(chǎn)酶類耐藥菌的比例約占所有耐藥菌的一半，但非產(chǎn)酶類耐藥菌也在逐漸引起重視。目前仍然有新的耐藥基因或亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，耐藥菌也大多表現(xiàn)出多重耐藥性，給臨床治療帶來較大壓力。盡管當下各個國家和地區(qū)對抗生素的使用已加強管理，CRE的感染率仍然在不斷上升，并以其高死亡率繼續(xù)威脅著患者的生命。通過研究CRE的耐藥機制，流行病學特征和危險因素等，可盡可能早地預知感染的發(fā)生和發(fā)展，同時建立耐藥菌的篩查制度，在對癥治療的同時從源頭對CRE的感染和傳播進行干預，在臨床工作中早預防、早發(fā)現(xiàn)、早治療。