基于正交試驗的根霉固態轉化坎利酮工藝條件優化

黃達明,杜卓蓉,張志才,管國強

(江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇 鎮江 212013)

坎利酮(canrenone)是一種甾體激素類心血管藥物,臨床上可用作醛固酮拮抗劑治療水腫、心衰、高血壓、肝腹水等疾病?？怖委熜难芗膊〉男Ч^為顯著,但若用于治療心臟病,可能存在用藥過量而導致死亡的危險后果,且其對強心劑地高辛(digoxin)的定量檢測有負面干擾[1]。因此人們開始通過生物或化學轉化的方法對坎利酮進行結構修飾,以期增強藥效并減少副作用。在坎利酮的眾多羥基化衍生物中,11α-羥基坎利酮受到廣泛關注。因為它是合成另一種心血管藥物依普利酮的重要醫藥中間體。依普利酮與坎利酮相比,副作用明顯減小[2]。因此,11α-羥基坎利酮具有極大的市場需求。

微生物可以通過其胞內的11α-羥化酶對甾體底物進行羥基化。國內外目前對甾體類化合物的微生物轉化研究都集中在液態發酵的領域。由于甾體化合物水不溶性的特性,在液態發酵過程中往往要添加各類表面活性劑作為底物助溶劑,增加底物在發酵液中的溶解度,從而提高轉化率[3-6]。如王森[4]利用黑根霉轉化16α,17α-環氧黃體酮,并添加吐溫為底物助溶劑,最終轉化率達到45%,KOLET S P等[5]利用毛霉轉化黃體酮,并添加四氫呋喃為底物助溶劑,最終轉化率達到94%,RESTAINO O F等[6]利用玫瑰產色鏈霉菌轉化氫化可的松,并添加二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)為底物助溶劑,最終轉化率達到(58±2.9)%；在底物為坎利酮的甾體化合物微生物液態發酵研究中,劉曉等[7]通過赭曲霉的高密度培養,在7 L發酵罐進行工藝放大,坎利酮轉化率為86.1%；黃達明等[8]通過優化轉化工藝條件,最終使坎利酮的轉化率達到87.68%；張曉麗等[9]則研究了單一乳化劑sp60、sp80、tw60、tw80和復合乳化劑對坎利酮增溶及轉化率的影響,最終通過添加復合乳化劑,使轉化率達到92.22%；CONTENTE M L等[10]通過赭曲霉富氧培養,并添加二甲基亞砜為坎利酮的助溶劑,使轉化率＞95%。

這些研究為坎利酮羥基化提供了理論依據,但液態發酵存在局限性:由于甾體類化合物不溶于水的特性會大大降低其在液態發酵液中的轉化率,所以大部分研究都選擇在液態發酵液中添加表面活性劑促進底物的溶解。但表面活性劑的添加對菌體的生長有一些影響,且實踐證明,添加了表面活性劑之后的甾體底物并不能完全溶于發酵液[11],而是以小顆粒的形態存在,這樣就會降低坎利酮的轉化率。固態發酵則可以解決以上問題,同時,固態發酵提取產物時對于提取劑沒有特殊要求,只需選擇有機溶劑如無毒的乙醇即可,而液態發酵需要選擇可以溶解11α-坎利酮卻不與發酵液互溶的乙酸乙酯進行萃取,乙酸乙酯是低毒溶劑,會對人體和環境產生不良影響[12-13]。

本研究擬利用根霉(Rhizopussp.)UJS-0602對坎利酮進行特異性轉化生成11α-羥基坎利酮,并優化固態發酵轉化坎利酮的培養基的組成和培養條件。以期證明新型固態發酵轉化坎利酮生成11α-羥基坎利酮的可能性,為后續的化學合成依普利酮提供必要的中間體。彌補了液態發酵轉化方法中存在的不足:解決液態發酵轉化過程中坎利酮甾體底物水不溶性的問題,提高轉化率,并使得產物提取過程綠色安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種為根霉(Rhizopussp.)UJS-0602:保藏于本實驗室菌物柜。

發酵基質大米:市售；坎利酮(分析純):浙江朗華制藥有限公司；甲醇(色譜級):美國TEDIA公司；其他試劑均為市售分析純。

保藏斜面為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基:取土豆200 g蒸煮后過濾得到浸出液,加入葡萄糖20 g并加水定容至1 000 mL。固態發酵轉化培養基組成為大米基質20g,自來水20mL,底物添加量為10%(按發酵基質質量計)。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀:日本Shimadzu公司；ZC-2102GZ光照恒溫搖床:常州中誠儀器制造有限公司；BCD-206TS冰箱:青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司；FA1004精密天平:上海天平儀器有限公司；XSP-BM-2CA生物顯微鏡:上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽滅菌器:上海三申醫療器械有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海三發科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養及底物轉化方法

斜面菌種制備:將根霉(Rhizopussp.)UJS-0602置于PDA培養基上,28℃環境下培養3～4 d,待培養斜面底部變成紅色,表面長滿金黃色孢子時,即得到生產斜面,于4℃冰箱冷藏保存,保藏時間在7 d以內。

孢子懸液制備:在無菌環境下,將無菌水加入生產斜面沖下孢子,加入無菌水計數調節孢子懸液濃度為108個/mL。

一級種子液培養:孢子懸浮液(108個/mL)以5%的接種量接入滅菌后的一級種子培養基中,在溫度為28℃,轉速為150 r/min的搖床中培養48 h后得到一級種子液。

固態發酵轉化:將所得的一級種子液接入滅菌后的固態發酵培養基中,接種量為0.1 mL/g發酵基質,在培養基pH=7,培養溫度為27℃的條件下發酵72～96 h后結束轉化。

1.3.2 單因素試驗

考察碳源種類(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、糊精、甘油)、碳源添加量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、氮源種類(蛋白胨、玉米蛋白粉、豆粕、酵母膏、牛肉膏、(NH4)2SO4、KNO3)、氮源添加量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、無機鹽種類(FeSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4)、營養因子種類(甘氨酸、VB2、VB6、VB12、3,5-二硝基水楊酸)、營養因子添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、料水比(1.0∶2、1.5∶2、1.0∶1、2.5∶2、3.0∶2(g∶mL))、底物添加量(10%、15%、20%、25%、30%)對底物轉化率的影響。

1.3.3 正交試驗

利用單因素試驗篩選出的初始條件設計正交試驗,即以轉化率為考察指標,選取碳源添加量(A)、氮源添加量(B)、營養因子(C)、料水比(D)、底物添加量(E)為正交試驗的5個因素,采用L16(45)正交試驗優化轉化培養基組成,正交試驗因素與水平見表1。

表1 培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.4 提取及檢測方法

取轉化后的固態發酵培養基2 g,加入50 mL無水乙醇,于150 r/min搖床中振蕩提取2 h后減壓抽濾得到濾液,再使用無水乙醇反復沖洗濾渣3次后合并濾液,于60℃條件下減壓蒸干,加入無水乙醇復溶后定容至50mL。用0.45μm有機濾膜過濾,供分析測定使用。

液相色譜柱為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(150mm×4.6 mm,5 μm)；測定條件根據文獻報道[14]作適當調整:以甲醇和水為流動相,利用甲醇溶液連續梯度洗脫,體積分數從60%升至80%,洗脫時間13.53 min；流速0.8 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫:30℃；進樣量5 μL。

取80℃烘干的11α-羥基坎利酮標品0.500 0 g,定容至100 mL,配制出5.0 g/L的母液,然后稀釋配制成0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L不同濃度梯度的稀釋液進行HPLC分析,繪制11α-羥基坎利酮的標準曲線,得到11α-羥基坎利酮質量濃度(Y)與吸收峰面積(X)的線性回歸方程為Y=6935788.56X+10587476.56,根據產物峰面積計算產物含量從而得到產物轉化率,其計算公式為:

式中:m0為產物測定質量,g；m為底物投入質量,g。

2 結果與分析

2.1 碳源種類及水平的確定

碳源是C11α-羥基化過程中重要的營養和能源物質,為菌體提供生長所需的碳架和轉化底物所需的代謝能,并為羥基化反應提供還原力,對甾體轉化過程影響較大。本實驗分別考察不同碳源對轉化率的影響,結果見圖1。

由圖1可知,與未添加碳源的對照組相比,葡萄糖與果糖作為培養基碳源時底物的轉化率較高,其中葡萄糖最有利于坎利酮的C11α-羥基化,轉化率可達90.39%。不同微生物對碳源的偏好性不同,不同碳源會影響代謝活動中各種酶的表達。本研究得到的最佳碳源為葡萄糖的結論與趙玉金等[15-16]研究得到的結果一致。這可能是由于葡萄糖是可以被菌體快速利用的碳源,菌體需要利用碳源生長繁殖后產生次級代謝產物羥化酶來催化底物的羥基化反應,且葡萄糖價廉易得,廣泛應用于工業化生產。因此選擇葡萄糖作為轉化培養基的最佳碳源。

在培養基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同比例的葡萄糖,考察葡萄糖添加量對轉化率的影響,結果如圖2所示。

由圖2可知,當葡萄糖添加量為1.0%時,轉化率最大為90.25%。這是由于葡萄糖為速效碳源,隨著葡萄糖添加量增加,提供的能量充足,而當葡萄糖添加量＞1.0%后,菌體代謝了過多葡萄糖,產生的熱量在固態發酵培養基中難以快速揮發,一定程度上影響了菌體的生長,繼而影響了菌體對底物的轉化。因此選擇葡萄糖添加量1.0%為宜。

2.2 氮源種類及水平的確定

氮源是構成菌體細胞的物質,如核酸、氨基酸和蛋白質等,并幫助細胞合成酶。涉及到酶的生物轉化需要合適足量的氮源。分別考察不同氮源對轉化率的影響,結果見圖3。

圖3 不同氮源對轉化率的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on conversion ratio

由圖3可知,(NH4)2SO4為氮源時,轉化率明顯高于對照組。因此選擇(NH4)2SO4為最佳氮源。在相關研究中[7,17],微生物羥基化坎利酮的最佳pH均為酸性,(NH4)2SO4可以為轉化提供弱酸性環境,便于菌體細胞利用。因此選擇(NH4)2SO4作為轉化培養基的最佳氮源。

在培養基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同比例的(NH4)2SO4,考察(NH4)2SO4添加量對轉化率的影響,結果如圖4所示。

由圖4可知,硫酸銨添加量在0.4%～0.8%時轉化率不斷升高,到0.8%時達到最大,之后轉化率略有降低。這說明當(NH4)2SO4添加量為0.8%時可以為菌體生長提供最適的弱酸性環境,轉化率最高為91.57%,當(NH4)2SO4含量繼續升高時,菌體的代謝途徑可能發生改變,產生用于促進底物羥基化的羥化酶含量減少,轉化率降低。因此選擇(NH4)2SO4添加量0.8%為宜。

圖4 不同硫酸銨添加量對轉化率的影響Fig.4 Effects of ammonia sulfate addition on conversion ratio

2.3 無機鹽種類的確定

考察不同種類無機鹽對轉化率的影響。結果見圖5。

圖5 不同無機鹽對轉化率的影響Fig.5 Effects of different inorganic salts on conversion ratio

由圖5可知,培養基中添加無機鹽對轉化率的提高沒有作用。微生物在生長繁殖及合成產物的過程中需要無機鹽中微量元素作為活性物質合成中的調節物。在產酶真菌酶活研究[18]中提到,無機鹽一般會在低濃度時促進微生物生長及產物合成,高濃度時則表現抑制作用:當無機鹽含量為0.5%～1.0%時,菌體產酶量可以穩定在較高水平,但當含量繼續上升時,產酶量表現為持續下降?？怖霓D化也是通過羥化酶的參與而完成的。本研究采用的固態發酵培養基是復合培養基,成分復雜,且此時無機鹽的額外添加量已經達到了1.0%,已經表現出對產物合成的抑制作用,因此轉化培養基中不需要再額外添加無機鹽。

2.4 營養因子種類及水平的確定

營養因子有助于菌體細胞構成成分的合成?？疾炝瞬煌N類營養因子對轉化率的影響。結果見圖6。

圖6 不同營養因子對轉化率的影響Fig.6 Effects of different nutritional factors on conversion ratio

由圖6可知,培養基中添加甘氨酸可以顯著提高轉化率。有研究表明,甘氨酸的存在可能會引起細胞壁結構的改變,導致酶等胞內容物更好地被動分泌至胞外[19],從而促進酶對底物的催化,提高轉化率。因此選擇甘氨酸作為轉化培養基的最佳營養因子。

在培養基中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的甘氨酸,考察甘氨酸添加量對轉化率的影響,結果如圖7所示。

圖7 不同甘氨酸添加量對轉化率的影響Fig.7 Effects of different glycine addition on conversion ratio

由圖7可知,甘氨酸添加量在0.8%時轉化率最高為89.02%,說明在該添加量條件下,甘氨酸可以最大限度促進胞內酶的被動運輸,又不至于對菌體細胞壁產生破壞,影響菌體生長代謝。因此選擇甘氨酸添加量0.8%為宜。

2.5 培養基水分含量對轉化率的影響

考察基質料水比對轉化率的影響。結果見圖8。

由圖8可知,當發酵基質料水比為1.0∶1(g∶mL)時,轉化率最大為86.76%,明顯高于其余各組。這是由于水分是發酵過程的主要媒介,是微生物生長必不可少的條件之一,水分含量太低會導致基質變干,微生物生長困難甚至死亡,轉化率會受到很大影響；而當含水量太高則導致發酵基質透氣性下降,影響菌體生長繁殖,同時發酵產生的熱量難以散發,基質溫度升高,增加了雜菌污染的危險,用于轉化的根霉生長受到抑制,轉化率降低。因此當料水比為1.0∶1(g∶mL)時,對于微生物轉化是最有利的。

圖8 培養基水分含量對轉化率的影響Fig.8 Effect of moisture content of medium on conversion ratio

2.6 底物添加量對轉化率的影響

考察不同底物添加量(10%、15%、20%、25%、30%)對轉化率的影響。結果見圖9。

圖9 底物添加量對轉化率的影響Fig.9 Effect of substrate addition on conversion ratio

由圖9可知,當底物添加量為10%時,轉化率最高可達82.88%。且當底物添加量逐漸增大時,轉化率不斷降低。這是由于過高的甾體化合物濃度對微生物具有一定毒害作用,會抑制其酶的活力[20]。CONTENTE M L等[10]也在坎利酮液態發酵的轉化研究中表明,只有當底物濃度保持在5～6 g/L時才會達到高轉化率,高濃度底物不僅會限制轉化率,也會由于羥基化發生的碳位不同而產生副產物。因此選擇底物添加量10%為宜。

2.7 固態發酵轉化培養基優化正交試驗

基于轉化培養基中各組分的單因素試驗結果,以轉化率為指標,選定葡萄糖、(NH4)2SO4、甘氨酸、料水比、底物添加量進行正交試驗,得到轉化培養基的最佳組成條件。正交試驗設計及結果見表2,方差分析見表3。

表2 培養基配方優化正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知,各因素影響轉化率的主次順序為A＞D＞C＞E＞B,即葡萄糖添加量對轉化率的影響最大,其次為料水比、甘氨酸添加量和底物添加量,氮源添加量對轉化率影響最小。從K值可知,最優發酵培養基配方組合為A3B1C3D3E4,即培養基組成為葡萄糖1.0%,硫酸銨0.6%,甘氨酸0.8%,料水比為1.0∶1(g∶mL),底物添加量為12%。在此條件下進行驗證試驗,最終轉化率可達94.21%。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知,葡萄糖和甘氨酸的添加量以及培養基料水比對轉化率的影響顯著(P＜0.05),其余因素對實驗結果影響不顯著(P＞0.05)。

3 結論

對根霉轉化坎利酮生成11α-羥基坎利酮的固態發酵轉化條件進行了條件優化,優化后的坎利酮發酵轉化條件為:葡萄糖1%,硫酸銨0.6%,甘氨酸0.8%,料水比為1.0∶1(g∶mL),底物添加量為12%。經驗證試驗,在最佳工藝條件下,轉化率可達到94.21%,高于前期研究。本研究證明了固態發酵轉化坎利酮的可行性,且轉化率高于液態發酵時坎利酮的轉化率,同時極大簡化了底物轉化和產物提取過程,解決了液態發酵對于甾體底物溶解性的局限,具有應用前景。

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