酸法提取蘋果渣中的果膠及其性質分析

任秋慧,盧韻朵,廖鮮艷,史吉平,劉 莉*

(1.中國科學院 上海高等研究院,上海 201210；2.上海大學 生命科學學院,上海 200444；3.上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海 200093)

蘋果是我國北方廣泛種植的經濟作物,也是常見的果汁原料。我國已成為全球最大的蘋果果汁生產國[1]。蘋果渣是果汁生產過程中的廢棄物,約占加工量的20%～25%[2],目前大量的蘋果渣未得到合理的利用,容易變酸變臭,對周邊環境造成嚴重污染[3],同時造成了巨大的資源浪費。

研究表明,干蘋果渣中含有15%～18%的果膠[4]。果膠主要由部分甲氧基化的半乳糖醛酸殘基組成,廣泛分布在水果和蔬菜中,作為新鮮細胞的結構單元及細胞之間的連接物質,其結構是基于1,4-鍵合的D-半乳糖醛酸[5]。它是一種具有良好水凝膠能力的天然高分子化合物,是聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織推薦使用的無添加量限制的天然營養保健添加劑。果膠作為一種有效的增稠劑和膠凝劑[6-7],廣泛地應用于食品(如果醬、果凍、水果制品、水果飲料濃縮物、果汁、甜點和發酵乳制品)[8]。同時,還廣泛應用于化妝品、造紙、印染、紡織、冶金、煙草、醫藥等領域[9]。另外,果膠還具有抗腹瀉和抗癌的功效,對于高血壓、高血脂、便秘等疾病具有一定的療效[10-11]。此外還能夠疏散人體中近一半的放射性元素[12]。

目前,果膠的提取方法主要有酸法、酶法、微波法、超聲法、離子交換法、草酸銨提取法等[2,13-19]。酸法提取果膠是用稀酸將植物細胞中非水溶性果膠轉化為水溶性果膠[20],提取方法較為成熟,操作方便,成本低,提取效率相對較高,被廣泛應用于工業生產[12]。

本試驗主要研究酸法提取果膠,首先以單因素試驗(包括酸的種類、pH值、溫度、時間、固液比)為基礎,再通過響應面法對提取條件進行優化,以獲得最佳的酸法提取果膠工藝條件。同時,對該法提取獲得的果膠的酯化度(degree of esterification,DE)和半乳糖醛酸含量等性質進行分析,以期對果膠的提取提供簡便易操作的可行性方案,同時可以根據所提取果膠的性質,為果膠的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣:蘋果榨汁后將果渣煮沸、洗滌、干燥、粉碎、過40目篩網,備用；鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、無水乙醇、半乳糖醛酸、氫氧化鈉(分析純):國藥集團化學試劑有限公司；咔唑(分析純):生工生物工程股份有限公司；葡聚糖標品:Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

ZHWY-110X50恒溫水浴搖床:上海智城儀器制造公司；IKA C-MAG HS 7磁力加熱攪拌器:上海碩光電子科技有限公司；MS3BS25旋渦混合器:艾卡(廣州)儀器設備有限公司；ZRD-5210全自動新型鼓風干燥箱:上海智城分析儀器制造有限公司；R22GⅢ高速冷凍離心機:日立儀器有限公司；H1全功能微孔板檢測儀:美國伯騰儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵:鄭州長城科工貿有限公司；HPLC-20A高效液相色譜儀:日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸法提取果膠的單因素試驗

稱取4 g蘋果渣,按適當的固液比加水,混合均勻。用不同的酸調節體系pH值至設定的pH值。置于恒溫水浴搖床中,調至設定的溫度,轉速180 r/min提取一定的時間。待反應結束后,將溶液定容至100 mL,從中取30 mL溶液在15 000 r/min條件下離心15 min。取20 mL上清液,加入60 mL無水乙醇,室溫靜置1 h后過濾,得到凍狀透明沉淀,烘干后稱取固體干質量,計算粗果膠得率。分別以酸的種類(鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸),加不同酸后調節體系pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5),水浴反應溫度(80℃、85℃、90℃、95℃、100 ℃),時間(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h),固液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16(g∶mL)為評價因素,研究果膠提取的最佳條件。

1.3.2 酸法提取果膠的響應面優化

基于單因素試驗結果,采用4因素3水平的(Box-Behnken Design,BBD)試驗設計,以pH值(X1)、溫度(X2)、時間(X3)、固液比(X4)為自變量,以粗果膠得率為響應值,優化酸法提取果膠的最佳條件。試驗因素與水平見表1。

表1 酸法提取條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for acid extraction conditions optimization

1.3.3 果膠分子質量的測定

將提取的果膠復溶于水,形成均勻的溶液,采用高效液相色譜法對果膠分子質量進行測定。使用凝膠色譜柱TSK gel Super Multipore PW-H。色譜條件:進樣量20 μL,流動相為H2O,流速為0.4 mL/min,柱溫35℃,采用示差折光檢測器(refractive index detector,RID)進行檢測。以分子質量分別為12.60 kDa、110.00 kDa和289.00 kDa葡聚糖為標準品,制作標準品分子質量與出峰保留時間曲線,根據標準曲線計算樣品分子質量。

1.3.4 果膠中半乳糖醛酸含量的測定

將提取的果膠復溶于水,形成均勻的溶液,由于果膠的主要成分為半乳糖醛酸,故一般可以用半乳糖醛酸的含量來表示果膠的純度,其含量越大,果膠的純度越高[21]。采用咔唑比色法測定果膠中的半乳糖醛酸含量,半乳糖醛酸在硫酸中與咔唑試劑會發生縮合反應,該反應會生成紫紅色絡合物,該絡合物在波長525 nm處有最大吸收。配制0、0.04 g/L、0.08 g/L、0.12 g/L、0.16 g/L、0.20 g/L半乳糖醛酸標準溶液,分別移取1 mL于6支離心管內,加入0.25 mL 0.15%咔唑乙醇溶液,混合均勻后迅速加入5 mL濃硫酸溶液,混合均勻。于85℃水浴10 min,冷水浴30 min。在波長525 nm條件下,測定吸光度值,以半乳糖醛酸質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

按照上述測定方法,以提取溶劑作為空白參比,測吸光度值。試驗樣品中的半乳糖醛酸含量按照公式(1)計算:

式中:x1為果膠樣品中半乳糖醛酸含量,%；c為半乳糖醛酸的質量濃度,g/L；V為果膠提取液的總體積,L；n為提取液的稀釋倍數；W為烘干后粗果膠沉淀的質量,g。

1.3.5 果膠酯化度的測定

將提取的果膠復溶于水,形成均勻的溶液,取5 mL均勻溶液加100 mL水,滴加酚酞,用0.02 mol/L的NaOH滴定至溶液呈淺粉色為滴定終點,記錄消耗的體積V1。加入0.5 mol/L的NaOH 20 mL,攪拌15 min后,加入等體積等濃度的鹽酸溶液,再攪拌15 min,紅色消失。滴加酚酞,然后用0.02 mol/L NaOH標準溶液滴定至出現粉紅色為終點。記錄消耗的體積V2(皂化滴定值)。按照公式(2)計算酯化度DE值:

式中:V1為初滴定NaOH消耗體積,mL；V2為皂化滴定NaOH消耗體積,mL；c1為氫氧化鈉濃度,0.02 mol/L；c3為鹽酸的濃度,0.5mol/L；V3為0.5mol/L的鹽酸的體積,20.0mL；c4為氫氧化鈉的濃度,0.49 mol/L；V4為0.49 mol/L的氫氧化鈉的體積,20.0 mL。

1.3.6 粗果膠得率、果膠提取率的測定

(1)粗果膠得率

冷卻后稱量質量,計算粗果膠得率。試驗樣品中的粗果膠得率按照公式(3)計算:

式中:x2為試驗樣品中的粗果膠得率,%；m為烘干后果膠沉淀的質量,g；V為果膠提取液的總體積,mL；v為用于醇沉的果膠清液體積,mL；w為試驗樣品中蘋果渣干粉的質量,g。

(2)果膠提取率

蘋果果膠的主要成分為半乳糖醛酸,故采用半乳糖醛酸在試驗樣品中所占比例表示果膠提取率。測定方法同1.3.4。試驗樣品中的半乳糖醛酸含量按照公式(4)計算:

式中:x3為試驗樣品中半乳糖醛酸含量,%；c為半乳糖醛酸的

質量濃度,g/L；V為果膠提取液的總體積,L；n為提取液的稀釋倍數；m為試驗樣品中蘋果渣干粉的質量,g。

2 結果與分析

2.1 酸法提取果膠的單因素試驗

2.1.1 酸種類對果膠提取效果的影響

在酸種類對果膠提取效果影響的單因素試驗中,選取的是工業上常用的4種酸:鹽酸(HCl)、硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、磷酸(H3PO4),調節體系pH至2.0。分別測定粗果膠得率及果膠提取率,提取結果如圖1所示。結果表明,在相同的提取條件下,不論是粗果膠得率還是果膠提取率,使用鹽酸提取的數值均為最高,分別達到23.75%和13.34%。其次是硝酸,分別為21.00%和13.20%。接下來是硫酸,分別為19.25%和11.75%。最低的為磷酸,分別為17.00%和10.95%。鹽酸的提取效果最佳,且原料易得,故選用鹽酸提取。

圖1 酸種類對粗果膠得率和果膠提取率的影響Fig.1 Effect of acids varieties on crude pectin yield and pectin extraction rate

2.1.2 pH值對果膠提取效果的影響

在pH值對果膠提取效果影響的單因素試驗中,分別測定體系pH值為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5時粗果膠得率和果膠提取率,結果如圖2所示。由圖2可知,在相同的提取條件下,無論是粗果膠得率還是果膠提取率,體系pH值為1.5時數值均為最高,分別達到27.88%和18.09%。當體系pH值為3.5時數值最低,僅有17.00%和9.82%。pH值過低會導致水溶性果膠進一步脫酯裂解,從而使果膠提取率降低[22]。另外試驗發現,在相同的提取溫度和提取時間條件下,溶液體系pH值越低,溶液顏色越接近紅色,會影響最終果膠產品的顏色,因此選擇pH1.5為酸法提取果膠的最佳pH值。

圖2 pH值對粗果膠得率和果膠提取率的影響Fig.2 Effect of pH on crude pectin yield and pectin extraction rate

2.1.3 反應溫度對果膠提取效果的影響

在反應溫度對果膠提取效果影響的單因素試驗中,分別測定了反應溫度為80℃、85℃、90℃、95℃、100℃時粗果膠得率和果膠提取率,提取結果如圖3所示。由圖3可知,在相同的提取條件下,粗果膠得率在反應溫度為95℃時,達到最高為31.44%。果膠提取率在反應溫度為100℃時,達到最高為26.55%。95℃上升至100℃的過程中,果膠提取率增長緩慢,基于實際工業生產操作成本考慮,選擇95℃為最佳反應溫度。

圖3 反應溫度對粗果膠得率和果膠提取率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on crude pectin yield and pectin extraction rate

2.1.4 反應時間對果膠提取效果的影響

在反應時間對果膠提取效果影響的單因素試驗中,分別測定了反應時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h時粗果膠得率和果膠提取率,提取結果如圖4所示。由圖4可知,在相同的提取條件下,當反應時間為1.0 h時,粗果膠得率和果膠提取率均最低,分別為26.53%和15.50%；粗果膠得率在反應時間為3.0 h時,達到最高為32.16%；果膠提取率在反應時間為1.5 h時,達到最高為16.90%。反應時間從1.5 h延長到3.0 h過程中,粗果膠得率增長并不顯著,趨于平緩,且基于實際工業生產操作過程中時間成本的考慮,選擇1.5 h為最佳反應時間。

圖4 反應時間對粗果膠得率和果膠提取率的影響Fig.4 Effect of reaction time on crude pectin yield and pectin extraction rate

2.1.5 固液比對果膠提取效果的影響

在固液比對果膠提取效果影響的單因素試驗中,分別測定了固液比為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16(g∶mL)時粗果膠得率和果膠提取率,結果如圖5所示。由圖5可知,在相同的提取條件下,粗果膠得率在固液比為1∶16(g∶mL)時,達到最高為28.40%。果膠提取率在固液比為1∶12(g∶mL)時,達到最高為19.65%。固液比從1∶12(g∶mL)增加至1∶16(g∶mL)過程中粗果膠得率增長趨于平緩,且基于實際工業生產操作過程中成本的考慮,盡量節約用水,選擇1∶12(g∶mL)為最佳固液比。而且當固液比過小時,溶液過于濃稠不便于操作。

圖5 固液比對粗果膠得率和果膠提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on crude pectin yield and pectin extraction rate

2.2 酸法提取果膠的響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上,采用4因素3水平的響應面試驗設計,以pH值(X1)、溫度(X2)、時間(X3)、固液比(X4)為自變量,以粗果膠得率(Y)為響應值,試驗設計及結果見表2,回歸模型方差分析見表3。

表2 酸法提取條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Designs and results of response surface methodology for acid extraction conditions optimization

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對表2中的試驗數據進行多項式回歸擬合,得到關于粗果膠得率(Y)對pH值(X1)、溫度(X2)、時間(X3)、固液比(X4)4個因素的二次多項回歸方程如下:

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

由表3可知,回歸模型達到極顯著水平(P＜0.001)；失擬項不顯著(P=0.377 2＞0.05),表明該二次多項回歸方程對試驗擬合情況良好,試驗誤差較小；并且該模型的R2=0.968 5,模型的校正決定系數R2=0.937 0,表示實測值與預測值高度相關,回歸模型與實測值能夠較好的擬合。變異系數(coefficient of variation,CV)=2.57%,CV數值較低,表明試驗穩定性好,試驗結果可靠。綜上所述,可以說明該模型與實際試驗擬合較好,自變量與響應值之間線性關系顯著,可以用于最佳試驗條件的預測。

由表3方差分析結果表明,一次項X3、X4,交互項X1X2、X1X3,二次項影響顯著(P＜0.05)；X1、X2、X12影響極顯著(P＜0.001)；X1X4、X2X3、X2X4、X3X4、X32、X42影響不顯著(P＞0.05)。從方差分析表可知,各因素對粗果膠得率的影響順序為X1＞X2＞X3＞X4,即pH值＞溫度＞時間＞固液比。利用Design-Expert V8.06軟件對試驗數據進行分析,得到表3方差分析結果中交互作用顯著的pH值和溫度以及pH值和時間的響應面3D圖如圖6所示,由圖6(a)可知,在溫度90～100℃,pH值在0.8～1.5的范圍內,兩者有顯著的增效作用；溫度在100～110℃,pH值在1.5～2.1的范圍內,隨著兩者升高,粗果膠得率反而降低。由圖6(b)可知,時間在1.0～1.5 h,pH值在0.8～1.2的范圍內,兩者有顯著的增效作用；時間在1.5～2.5h,pH值在1.2～1.8的范圍內,隨著兩者升高,粗果膠得率反而降低。

圖6 pH值、溫度、時間交互作用對粗果膠得率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between pH,temperature and time on crude pectin yield

通過模型預測最佳的工藝參數為:溶液的體系pH值1.47,溫度100 ℃,時間2.0 h,固液比為1∶14(g∶mL),在此最佳工藝條件下,預測粗果膠得率為32.96%。為了驗證模型的可靠性,并根據實際的可操作性,對最優的條件進行了試驗驗證,得出最佳條件為:溶液的體系pH值1.5,溫度100℃,時間2.0 h,固液比1∶14(g∶mL),實際蘋果果渣粗果膠得率為33.12%,與理論預測值相比誤差為0.49%。因此,酸法提取蘋果渣中果膠最佳工藝參數為:pH值1.5,溫度100℃,時間2.0 h,固液比1∶14(g∶mL),蘋果渣粗果膠得率為33.12%,此時,果膠提取率為19.65%。采用響應面優化得到的酸法提取蘋果渣果膠的條件參數具有實用參考價值。

2.3 酸法提取果膠的性質分析

通過高效液相色譜法得知,酸法提取的果膠樣品的分子質量主要分布在165.92 kDa、5.83 kDa與0.45 kDa范圍內。試驗中,酸法提取的果膠的酯化度為60.90%,屬于高酯果膠,主要應用于糖果工業,用來制造軟糖及膠凍夾心,此外,還可應用于生產乳制品,可有效地穩定酸奶制品并改善風味[22]。

將該酸法與其他方法提取得到的果膠性質進行比較,結果見表4。由表4可知,該方法提取的果膠酯化度略低于其他方法,但半乳糖醛酸的含量很高,為70.48%。同時,相較于酶法提取而言,該酸法提取果膠的半乳糖醛酸含量也較高,可能原因是酶法提取果膠過程中添加了酶,酶中含有溶于水不溶于乙醇的雜質,醇沉時隨果膠沉淀下來,致使果膠中半乳糖醛酸含量較低,即純度較低。本研究中提取的果膠中半乳糖醛酸含量較高,說明純度更高,更具有明顯的優勢。

表4 不同方法提取的果膠性質比較Table 4 Comparison of the properties of pectin extracted by different methods

3 結論

通過單因素試驗及響應面優化試驗得出酸法提取蘋果渣中果膠的最佳工藝為:鹽酸調節反應pH值1.5,溫度100 ℃,時間2 h,固液比1∶14(g∶mL)。在此最佳條件下,果膠得率為33.12%,果膠提取率為19.65%。所得到的粗果膠產品,其半乳糖醛酸含量為70.48%,純度較高,酯化度為60.90%,屬于高酯果膠,該方法簡便,試劑易得,成本較低,適宜用在工業生產,為蘋果渣的合理利用提供有利的途徑。

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