米糠中產(chǎn)γ-氨基丁酸細(xì)菌分離及其接種發(fā)酵研究

董 玲,姚英政,梁 強(qiáng),李治華,朱 宇*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所,四川 成都 610061)

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1],對人具有治療高血壓[2-3]、糖尿病[4]、失眠和抑郁[5-6],激活肝臟[5]和保護(hù)腎臟[7]等功能；對畜禽具有促進(jìn)采食、抗應(yīng)激、鎮(zhèn)靜和提高生產(chǎn)性能等生理功能[8-9]。此外,長期食用富含GABA的食物有利于抑制癌細(xì)胞增殖、預(yù)防糖尿病和維持身體健康[1,5]。獲得GABA的方法主要有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法[10]。與前兩者比起來,通過微生物發(fā)酵來提高食品中GABA含量是一種安全有效的途徑[1,5,11]。乳酸菌具有安全性高、在食品工業(yè)應(yīng)用廣泛、高產(chǎn)GABA菌種種類豐富的特點(diǎn)[1,5,12],因此,利用乳酸菌發(fā)酵獲得富含GABA食品已成為近年來食品發(fā)酵領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。如KO C Y等[6,13-14]分別利用產(chǎn)GABA的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)和短乳桿菌(Lactobacillus brevis)發(fā)酵來提高豆奶的GABA含量；SHAN Y等[15-17]分別利用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(L.brevis)和乳酸乳球菌(L.lactis)發(fā)酵來制作富含GABA乳制品；CODA R等[18-20]分別用產(chǎn)GABA的植物乳桿菌(L.plantarum)和乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌(L.lactis)、短乳桿菌(L.brevis)發(fā)酵面團(tuán)來制作富含GABA面包；WORAHARN S等[21]利用短乳桿菌(L.brevis)和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)發(fā)酵有效提高了猴頭菇中GABA含量等。

米糠是稻谷加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物,約占稻谷質(zhì)量的6%～8%,近年來我國稻谷產(chǎn)量均＞2億t[22],按照2億t稻谷產(chǎn)量計算,則每年至少產(chǎn)生1 200萬t米糠。米糠營養(yǎng)豐富,含有蛋白質(zhì)約15%,脂肪16%～22%,以及多種生物活性物質(zhì),如生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷維素等,但對米糠的深加工研究還集中在單一成分的提取[23]。本研究通過分離米糠中具有高產(chǎn)GABA能力的菌株,將其用于米糠發(fā)酵,將米糠中豐富的谷氨酸[23-24]轉(zhuǎn)化成GABA,以期獲得富含GABA的發(fā)酵產(chǎn)品,有利于提高米糠附加值,延伸米糠加工產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)DY:本課題組分離自南充冬菜；菌株L-44A:分離自瀘州立石鎮(zhèn)陳米糠樣品(L)；新鮮米糠(-20℃保存):四川航粒香米業(yè)有限公司；在室溫條件下存放3個月的新米糠樣品(X1)、在室溫條件下存放12個月的陳米糠樣品(X2):南充市西充縣；在室溫條件下存放12個月的陳米糠樣品(L):瀘州市立石鎮(zhèn)。

GABA標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司；水解蛋白酶(0.6AU/g)、風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g),諾維信(中國)投資有限公司；A液體培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[25]配制；MRS培養(yǎng)基:青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；KF肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基:上海哈靈生物科技有限公司；薄層硅膠板:青島海浪硅膠干燥劑有限公司；瓊脂粉、谷氨酸鈉(均為生化試劑):成都市科龍化工試劑廠；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)Master Mix:天根生化科技(北京)有限公司；引物27F(5′-3′):AGAGTTTGATCMTGGCTCAG、引物1492R(5′-3′):GGYTACCTTGTTACGACTT:上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-6S1二級生物安全柜:新加坡Esco公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器:上海迅博實(shí)業(yè)有限公司；5810R臺式冷凍離心機(jī):德國Eppendorf公司；FlexCycle PCR儀:德國耶拿分析儀器有限公司；ZHWY-211B恒溫振蕩培養(yǎng)箱:上海智城分析儀器制造有限公司；SUP-250生化培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HBM-400B拍擊式均質(zhì)器:天津恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)GABA菌株分離

分別在50 mL A液體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、KF液體培養(yǎng)基和M17液體培養(yǎng)基中添加0.5 g谷氨酸鈉和2.5 g新鮮米糠,121℃滅菌15 min。將2 g待分離米糠樣品分別加入上述4種培養(yǎng)基,在35℃條件下靜置培養(yǎng)72 h。取培養(yǎng)物1mL接種到相應(yīng)液體培養(yǎng)基中,重復(fù)培養(yǎng)兩次,獲得富集培養(yǎng)物。用薄層層析法檢測富集培養(yǎng)物中GABA產(chǎn)量,對GABA斑點(diǎn)明顯的樣品進(jìn)行梯度稀釋,取1 mL 10-6、10-7、10-8稀釋度的液體于培養(yǎng)皿中,傾倒相應(yīng)固體培養(yǎng)基混勻,30℃培養(yǎng)48 h,挑取單菌落到液體培養(yǎng)基(含谷氨酸鈉1 g/100 mL)中,30℃靜置培養(yǎng)72 h,用薄層層析法對發(fā)酵液GABA進(jìn)行檢測,初步篩選出產(chǎn)GABA菌落。對產(chǎn)GABA菌落進(jìn)行進(jìn)一步劃線純化得到純菌株,篩選菌落形態(tài)不同的菌株。將純菌株接種到含谷氨酸鈉(1 g/100 mL)的相應(yīng)培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)72 h,通過薄層層析篩選出產(chǎn)量比較高的菌株,然后用氨基酸自動分析儀測定其發(fā)酵液中GABA含量。

1.3.2 產(chǎn)GABA菌株16 S rDNA序列分析

將11株GABA產(chǎn)量較高的菌株接種到相應(yīng)液體培養(yǎng)基中,30℃、120 r/min,振蕩培養(yǎng)48 h,取1 mL菌液按照DNA提取試劑盒說明進(jìn)行DNA提取。參照何培新等[26]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測序。去掉序列首尾40個堿基,利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性分析。

1.3.3 發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA試驗(yàn)

(1)種子菌液培養(yǎng)

將1.3.1分離得到的發(fā)酵液體培養(yǎng)基GABA產(chǎn)量高于500 mg/100 mL的菌株接種到20 mL MRS液體培養(yǎng)基中,30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)18 h,然后以1%(V/V)接種量接種到經(jīng)121℃、15 min滅菌處理的米糠水混合物(新鮮米糠添加量為5 g/100 mL)中,30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子發(fā)酵劑。

(2)單菌種發(fā)酵試驗(yàn)

將種子發(fā)酵劑以1%(V/V)接種量接種到米糠水混合物(新鮮米糠添加量為5 g/100 mL)中,分別在30℃、37℃培養(yǎng)72 h,用MRS固體培養(yǎng)基檢測菌落總數(shù),采用薄層層析法檢測發(fā)酵液中GABA。

(3)混合發(fā)酵試驗(yàn)

盡管與宋內(nèi)志賀桿菌(Shigella sonnei)相似性最高的菌株L-12A在液體培養(yǎng)基中GABA產(chǎn)量最高,與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)相似性最高的菌株L-44A次之,但從安全性方面考慮,選取與短乳桿菌(L.brevis)相似的菌株L-44A為代表進(jìn)行混合菌種米糠發(fā)酵試驗(yàn)。地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶豐富,且菌株DY分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品冬菜,安全性高,因此選擇該菌株與菌株L-44A混合發(fā)酵。

菌株L-44A與地衣芽孢桿菌DY種子菌液(1∶1,V/V)以1%(V/V)接種量接種到米糠水混合物(米糠添加量為5 g/100 mL)中,分別在30℃、37℃條件下靜置發(fā)酵72 h、120h、168h。采用薄層層析法初步檢測發(fā)酵液,選出GABA含量最高的發(fā)酵液,采用氨基酸自動分析儀檢測其GABA含量。

(4)酶解處理米糠發(fā)酵試驗(yàn)

將15 g米糠加入150 mL蒸餾水中,用2 mol/L NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0,分別加入0.30 g水解蛋白酶和0.30 g風(fēng)味蛋白酶混勻后,55℃水浴8 h,每隔2 h攪拌一次,酶解結(jié)束后加入150 mL蒸餾水,使米糠終含量為5 g/100 mL,121℃滅菌15 min,將菌株L-44A種子菌液以1%(V/V)接種量接種到該米糠中,30℃靜置發(fā)酵72 h、120 h、168 h,采用薄層層析法初步檢測發(fā)酵液,選出GABA含量最高的發(fā)酵液,采用氨基酸自動分析儀檢測其GABA含量。

1.3.4 發(fā)酵液GABA檢測

薄層層析檢測參考文獻(xiàn)[27]方法,發(fā)酵液于6 000×g離心10 min,取1 μL上清液在硅膠薄層層析板上點(diǎn)樣,展層劑組成為正丁醇∶冰醋酸∶蒸餾水(4∶1∶3,V/V),展層劑中茚三酮含量為0.4 g/100 mL,以含量為0.2%的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照,展開后于105℃顯色5 min,拍照。GABA含量送四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心采用氨基酸自動分析儀測定。檢測條件:陽離子樹脂(150 mm×4.6 mm),檢測波長570 nm、440 nm,柱溫為57～74℃梯度溫度,洗脫液流速為0.45 mL/min,反應(yīng)溫度為130℃。培養(yǎng)基發(fā)酵液于6 000×g離心10 min后取上清進(jìn)行測定；米糠發(fā)酵物在-20℃冷凍24 h,再冷凍干燥48 h后進(jìn)行測定。凍干樣品用6 mol/L HCl水解后進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA菌種分離與鑒定

米糠富集液GABA薄層層析檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知,X1樣品的4種培養(yǎng)基富集液樣品中GABA斑點(diǎn)均不明顯；X2樣品采用A培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、KF培養(yǎng)基富集有斑點(diǎn),A培養(yǎng)基斑點(diǎn)最明顯；L樣品的4種培養(yǎng)基富集液都有明顯斑點(diǎn)。由此可以推斷陳米糠中產(chǎn)GABA菌株比新米糠多或者產(chǎn)GABA能力強(qiáng),從陳米糠中更容易分離得到產(chǎn)GABA菌株。由于X1樣品的4種富集液均未檢測出明顯GABA條帶,所以不對X1樣品的富集液進(jìn)行GABA菌株分離；X2樣品MRS液體培養(yǎng)基富集液未檢測到明顯的GABA條帶,后續(xù)試驗(yàn)中對X2樣品的A、M17和KF培養(yǎng)基富集液中產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行分離；L樣品的4種培養(yǎng)基富集液均檢測出較明顯的GABA條帶,對其4種培養(yǎng)基富集液均進(jìn)行產(chǎn)GABA菌株分離。

從富集液的稀釋液培養(yǎng)平板上挑取單菌落,接種到液體培養(yǎng)基(含谷氨酸鈉1 g/100 mL)中,30℃靜置培養(yǎng)72 h,經(jīng)薄層層析檢測,所挑取菌落中產(chǎn)GABA的菌株數(shù)見表1。由表1可知,L樣品富集液中分離到產(chǎn)GABA菌株最多,與圖1顯示的L樣品富集液GABA斑點(diǎn)最明顯相吻合。通過薄層層析檢測米糠富集液中GABA含量,從有目標(biāo)條帶的富集液中分離,減少了分離盲目性。

表1 米糠富集液分離產(chǎn)GABA菌株數(shù)Table 1 Numbers of GABA-producing strains isolated from enrichment culture of rice bran

圖2 菌株發(fā)酵液中GABA檢測薄層層析圖Fig.2 Thin-layer chromatogram of GABA in strains fermentation solution

表2 菌株發(fā)酵液中GABA含量及菌株16S rDNA相似性Table 2 GABA content in strains fermentation broth and 16S rDNA similarity of strains

由圖2可知,泳道4、5、7和9發(fā)酵液GABA濃度較高,泳道8、10有微弱條帶,泳道6、11、12沒有檢測出GABA。通過薄層層析,篩選出11株GABA含量較高的菌株,編號分別為:L-1A、L-7A、L-12A、L-30A、L-44A、L-1MRS、L-7MRS、L-13MRS、L-24MRS、L-8M17、X2-25M17。篩選出的11株菌的發(fā)酵液GABA檢測結(jié)果和菌株16S rDNA序列相似性比對結(jié)果見表2。由表2可知,通過16S rDNA比對,菌株L-7MRS、L-8M17、X2-25M17與腸球菌屬(Enterococcus)相似性最高(99.86%～100.00%)；菌株L-30A、L-1A、L-1MRS與埃希氏菌屬(Escherichia)相似性最高(99.20%～99.85%)；菌株L-44A、L-13MRS、L-24MRS與乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相似性最高(99.86%)；菌株L-12A、L-7A與志賀氏菌屬(Shigella)相似性最高(99.79%～99.86%),據(jù)此推斷米糠中可培養(yǎng)產(chǎn)GABA的菌株主要屬于腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和志賀氏菌屬(Shigella)。菌株L-8M17、X2-25M17、L-12A、L-44A、L-24MRS的GABA產(chǎn)量均＞500mg/100mL,它們分別與棉籽腸球菌(Enterococcus raffinosus)、宋內(nèi)志賀桿菌(Shigella sonnei)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)相似性最高(99.86%～99.93%),其中與宋內(nèi)志賀桿菌(Shigella sonnei)相似的菌株L-12A的GABA產(chǎn)量最高,為572.99mg/100mL。GABA產(chǎn)量＞500mg/100mL的菌種中有4株從瀘州市立石鎮(zhèn)陳米糠分離,僅1株從南充市陳米糠分離。

2.2 發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA試驗(yàn)

2.2.1 單菌種米糠發(fā)酵試驗(yàn)

選擇液體培養(yǎng)基發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量高于500mg/100mL的菌株L-8M17、X-25M17、L-12A、L-44A、L-24MRS,接種到5%米糠中進(jìn)行發(fā)酵,菌落數(shù)測定結(jié)果見表3。由表3可知,5株菌在米糠中均有生長。將所有菌株的米糠發(fā)酵液進(jìn)行薄層層析,檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知,所有產(chǎn)GABA菌株接種在米糠中,于30℃、37℃發(fā)酵72 h,通過薄層層析均未檢測到GABA斑點(diǎn),說明盡管菌株能夠在米糠中生長,但其在30℃、37℃發(fā)酵72 h不能明顯提高GABA含量。

表3 發(fā)酵米糠中菌落計數(shù)結(jié)果Table 3 Colony count results in fermented rice bran

圖3 單菌種米糠發(fā)酵液中GABA檢測薄層層析圖Fig.3 Thin-layer chromatogram of GABA in rice bran fermented by single species

2.2.2 混合菌種米糠發(fā)酵試驗(yàn)

通過薄層層析檢測單獨(dú)接種地衣芽孢桿菌DY、混合接種地衣芽孢桿菌DY和乳酸菌L-44A分別在30℃、37℃條件下發(fā)酵72 h、120 h、168 h的發(fā)酵液,檢測結(jié)果見圖4。由圖4可知,僅接種地衣芽孢桿菌DY的米糠在30℃、37℃發(fā)酵72 h、120 h、168 h均沒有檢測到GABA斑點(diǎn),說明地衣芽孢桿菌DY沒有發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的能力。混合接種地衣芽孢桿菌DY和乳酸菌L-44A的米糠在30℃條件下發(fā)酵72 h和120 h都沒有檢測到GABA斑點(diǎn),發(fā)酵168 h檢測出微弱的斑點(diǎn)；其在37℃條件下發(fā)酵72 h沒有檢測到GABA斑點(diǎn),發(fā)酵120 h檢測出微弱斑點(diǎn),發(fā)酵168 h檢測出明顯斑點(diǎn),GABA含量隨著時間的延長在逐漸增加。用氨基酸自動分析儀檢測混合接種地衣芽孢桿菌DY和乳酸菌L-44A在37℃下發(fā)酵168 h的米糠中GABA含量為184.6 mg/100 g(干質(zhì)量)。試驗(yàn)結(jié)果表明,混合接種地衣芽孢桿菌和乳酸菌L-44A的米糠經(jīng)過發(fā)酵可以提高其GABA含量,但其需要的發(fā)酵時間比較長；相對而言,37℃條件下更適合混合接種發(fā)酵。

圖4 米糠接種混合菌種發(fā)酵液中GABA檢測薄層層析圖Fig.4 Thin-layer chromatogram of GABA in rice bran fermented by multi-strains

2.2.3 酶解處理米糠發(fā)酵試驗(yàn)

酶解米糠接種菌株L-44A在30℃發(fā)酵72h、120h、168h,薄層層析檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知,酶解米糠接種菌株L-44A在30℃發(fā)酵72 h、120 h、168 h均產(chǎn)生了GABA,發(fā)酵72 h的GABA斑點(diǎn)與發(fā)酵120 h的相比差異不大,發(fā)酵時間延長到168 h,GABA含量有所提高。氨基酸自動分析儀檢測結(jié)果表明,發(fā)酵168 h的酶解米糠發(fā)酵液中GABA含量為245.8 mg/100 g(干質(zhì)量)。

圖5 酶解米糠發(fā)酵液中GABA檢測薄層層析圖Fig.5 Thin-layer chromatogram of GABA in enzymatic rice bran fermentation solution

2.3 討論

通過對米糠中產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行分離,得到了11株GABA產(chǎn)量較高的菌株,通過16S rDNA相似性比對,它們分別與屎腸球菌(Enterococcus faecium)、棉子腸球菌(Enterococcus raffinosus)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)和宋內(nèi)志賀桿菌(Shigella sonnei)相似性最高,表明米糠中產(chǎn)GABA菌株比較豐富。對于安全性比較高的糞腸球菌、棉子腸球菌和短乳桿菌可以用于進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵研究,開發(fā)富含GABA產(chǎn)品。

當(dāng)分離自米糠的產(chǎn)GABA乳酸菌或其他細(xì)菌接種到未添加谷氨酸的米糠中進(jìn)行發(fā)酵,未檢測到GABA斑點(diǎn),以此推斷此次分離的產(chǎn)GABA菌株無法單獨(dú)利用米糠中豐富的谷氨酸[23-24]轉(zhuǎn)化成GABA。然而,通過蛋白酶水解米糠后再接種產(chǎn)GABA乳酸菌或者未經(jīng)處理的米糠接種具有蛋白酶活力的地衣芽孢桿菌和產(chǎn)GABA乳酸菌混合發(fā)酵,米糠發(fā)酵液中能檢測出GABA斑點(diǎn),且經(jīng)過氨基酸自動分析儀分析,其GABA含量分別達(dá)到245.8 mg/100 g(干質(zhì)量)和184.6 mg/100 g(干質(zhì)量)。根據(jù)YANG T等[28-30]的報道,乳酸菌需要利用添加的谷氨酸合成GABA,試驗(yàn)中經(jīng)蛋白酶酶解或接種具有產(chǎn)蛋白酶能力的地衣芽孢桿菌處理,再接種產(chǎn)GABA菌株獲得了富含GABA發(fā)酵產(chǎn)物,可能與米糠蛋白被酶分解,產(chǎn)生了可被產(chǎn)GABA菌株利用的谷氨酸底物有關(guān)。因此可通過添加蛋白酶或者接種具有很強(qiáng)產(chǎn)蛋白酶能力的菌株對米糠進(jìn)行處理,再結(jié)合高產(chǎn)GABA菌株發(fā)酵來提高米糠中GABA含量。

3 結(jié)論

米糠中含有多種產(chǎn)GABA細(xì)菌。通過添加蛋白酶處理米糠后接種產(chǎn)GABA乳酸菌L-44A在30℃條件下發(fā)酵168 h使米糠中GABA含量達(dá)到245.8 mg/100 g(干質(zhì)量),混合接種地衣芽孢桿菌和產(chǎn)GABA乳酸菌在37℃條件下發(fā)酵168 h的米糠中GABA含量為184.6 mg/100 g(干質(zhì)量),說明酶處理效果比混合接種效果好。雖然通過發(fā)酵使米糠中GABA含量增加了很多,但二者發(fā)酵時間都比較長。

發(fā)酵的pH值、溫度、時間、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)和鈣離子的添加量等因素會影響GABA的產(chǎn)量[1,12]。對比混合接種地衣芽孢桿菌和乳酸菌在30℃和37℃發(fā)酵的薄層層析圖,37℃發(fā)酵液明顯比30℃的GABA含量高；在37℃條件下發(fā)酵72 h、120 h、168 h,薄層層析檢測到的GABA斑點(diǎn)顏色有由淺到深的變化,說明溫度、發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量影響較大。在后續(xù)工作中可以對發(fā)酵的pH值、PLP和鈣離子添加量等因素對發(fā)酵的效果進(jìn)行研究,進(jìn)一步提高發(fā)酵米糠中GABA含量。

[1]DHAKALR,BAJPAI V K,BAEK K H.Production of GABA(γ-aminobutyric acid)by microorganisms:a review[J].Braz J Microbiol,2012,43(4):1230-1241.

[2]YOSHIMURA M,TOYOSHI T,SANO A,et al.Antihypertensive effect of a γ-aminobutyric acid rich tomato cultivar'DG03-9'in spontaneously hypertensive rats[J].J Agr Food Chem,2010,58(1):615-619.

[3]BECERRA-TOMáS N,GUASCH-FERRé M,QUILEZ J,et al.Effect of functional bread rich in potassium,γ-aminobutyric acid and angiotensinconverting enzyme inhibitors on blood pressure,glucose metabolism and endothelial function:a double-blind randomized crossover clinical trial[J].Medicine,2015,94(46):1807-1817.

[4]SOLTANI N,QIU H,ALEKSIC M,et al.GABA exerts protective and regenerative effects on islet beta cells and reverses diabetes[J].P Natl Acad Sci,2011,108(28):11692-11697.

[5]DIANA M,QUíLEZ J,RAFECAS M.Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods:a review[J].J Funct Food,2014,10(3):407-420.

[6]KO C Y,LIN H T V,TSAI G J.Gamma-aminobutyric acid production in black soybean milk byLactobacillus brevisFPA 3709 and the antidepressant effect of the fermented product on a forced swimming rat model[J].Process Biochem,2013,48(4):559-568.

[7]DUNN K,PEPPIATT-WILDMAN C M,KELLEY S P,et al.Current perspective on the location and function of gamma-aminobutyric acid(GABA)and its metabolic partners in the kidney[J].J Nephrol Urol Res,2014,2(2):47-57.

[8]施忠秋,齊智利.γ-氨基丁酸調(diào)控采食量和緩解熱應(yīng)激的機(jī)制[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2014,26(1):49-53.

[9]袁志平,羅軍榮.γ-氨基丁酸在動物生產(chǎn)中抗熱應(yīng)激研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī),2016,48(6):137-141.

[10]王志超,楊平平,王 燕,等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品,2015,40(11):115-119.

[11]HUDEC J,KOBIDA L’,CˇANIGOVá M,et al.Production of γ-aminobutyric acid by microorganisms from different food sources[J].J Sci Food Agr,2015,95(6):1190-1198.

[12]XU N,WEI L,LIU J.Biotechnological advances and perspectives of gamma-aminobutyric acid production[J].World J Microbiol Biotechnol,2017,33(3):64-75.

[13]SONG H Y,YU R C.Optimization of culture conditions for gammaaminobutyric acid production in fermented adzuki bean milk[J].J Food Drug Anal,2017.https://doi.org/10.1016/j.jfda.2016.11.024

[14]LIAO W C,WANG C Y,SHYU Y T,et al.Influence of preprocessing methods and fermentation of adzuki beans on γ-aminobutyric acid(GABA)accumulation by lactic acid bacteria[J].J Functional Food,2013,5(3):1108-1115.

[15]SHAN Y,MAN C X,HAN X,et al.Evaluation of improved γ-aminobutyricacidproductionin yogurt usingLactobacillusplantarumNDC75017[J].J Dairy Sci,2015,98(4):2138-2149.

[16]WU Q,SHAH N P.High γ-aminobutyric acid production from lactic acid bacteria:emphasis onLactobacillus brevisas a functional dairy starter[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2016,57(17):3661-3672.

[17]HAGI T,KOBAYASHI M,NOMURA M.Metabolome analysis of milk fermented by γ-aminobutyric acid-producingLactococcus lactis[J].J Dairy Sci,2016,99(2):994-1001.

[18]CODA R,RIZZELLO C G,GOBBETTI M.Use of sourdough fermentation and pseudo-cereals and leguminous flours for the making of a functional bread enriched of γ-aminobutyric acid(GABA)[J].Int J Food Microbiol,2010,137(2):236-245.

[19]BHANWAR S,BAMNIA M,GHOSH M,et al.Use ofLactococcus lactis to enrich sourdough bread with γ-aminobutyric acid[J].Int J Food Sci Nutr,2013,64(1):77-81.

[20]DIANA M,RAFECAS M,QUíLEZ J.Sourdough bread enriched with γ-aminobutyricacid(GABA).Acomparison offree amino acid,biogenic amine and acrylamide content in GABA-enriched sourdough and commercial breads[J].J Cereal Sci,2014,60(3):639-644.

[21]WORAHARN S,LAILERD N,SIVAMARUTHI B S,et al.Evaluation of factors that influence the L-glutamic and γ-aminobutyric acid production duringHericium erinaceusfermentation by lactic acid bacteria[J].CyTA-J Food,2016,14(1):47-54.

[22]吳 偉,蔡勇建,林親錄,等.米糠貯藏時間對米糠清蛋白功能性質(zhì)的影響[J].中國油脂,2015,40(10):15-19.

[23]周顯青,楊繼紅,張玉榮.國內(nèi)外米糠資源利用現(xiàn)狀與發(fā)展[J].糧食加工,2014(5):24-29.

[24]嚴(yán) 聃.發(fā)酵法從米糠中提取高濃度γ-氨基丁酸粉末的工藝研究[J].湖南科技學(xué)院學(xué)報,2009,30(4):89-90.

[25]林親錄,李麗輝,王 婧,等.從米糠發(fā)酵液中篩選產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株[J].食品與機(jī)械,2008,24(3):6-9.

[26]何培新,李芳莉,鄭 燕,等.濃香型白酒窖泥梭菌的分離及其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析[J].中國釀造,2017,36(4):45-49.

[27]董 玲,姚英政,朱 宇.短乳桿菌發(fā)酵提高糙米中γ-氨基丁酸含量的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2016,12(3):19-22.

[28]YANG T,RAO Z,KIMANI B G,et al.Two-step production of gamma-aminobutyric acid from cassava powder usingCorynebacterium glutamicumandLactobacillus plantarum[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2015,42(8):1157-1165.

[29]JORGE J M P,LEGGEWIE C,WENDISCH V F.A new metabolic route for the production of gamma-aminobutyric acid byCorynebacteriumglutamicumfromglucose[J].Amino Acids,2016,48(11):2519-2531.

[30]蔣冬花,高愛同,畢 珂,等.乳酸菌發(fā)酵小米糠生產(chǎn)γ-氨基丁酸的配方和條件優(yōu)化[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,36(1):6-10.