沉香型酒醅中產香芽孢桿菌的分離鑒定及代謝產物分析

吳樹坤,楊 磊,楊玲麟,余 輝,黃治國*

(1.四川理工學院 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川 自貢 643000；2.中國沈酒集團,四川 瀘州 646000)

中國白酒以開放式固態釀造、多菌復合發酵的獨特方式,在世界蒸餾酒中獨樹一幟。根據其不同的釀造工藝及獨特口感主要分為濃、清、米、醬四大香型,在此基礎上又衍生出了許多其他的香型,沉香型白酒是在清、濃、醬三大香型的基礎上創新研發出的一種新的香型。沉香型白酒生產用曲為高溫大曲,其加入了26種中藥材使沉香型白酒中帶有藥香,將大曲拌入混合糧(高粱、稻殼和母糟)中進行堆積后,再入窖發酵[1]。獨特的工藝使得沉香型白酒具有清澈透明,清、濃、醬香氣馥郁,沉香怡人、醇厚綿甜、圓潤協調、余味爽凈等典型風格。

近年來,隨著白酒行業的發展,研究人員對白酒釀造過程中的微生物體系研究越來越多,其中芽孢桿菌的功能性被多次報道[2-4],許多芽孢桿菌都具有產淀粉酶、蛋白酶等能力,且大多數芽孢桿菌具有很強的環境適應力,這有利于釀造過程中酶系的積累和原料的利用。故分離并應用具有優良性能的芽孢桿菌具有重要的意義。趙長青等[5]從濃香型酒醅及其大曲中分離得到一株產己酸乙酯較高且產正丙醇較低的蠟質芽孢桿菌,其產己酸乙酯的含量達到國標高度優級酒的范圍；楊春霞等[6]從牛欄山二鍋頭酒醅中分離得到5株產風味較好的芽孢桿菌,其中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和兩株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)主要代謝的風味物質為3-羥基-2-丁酮,而短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的主要風味物質為苯乙醇。目前尚鮮見有關于沉香型白酒的研究報道,因此研究沉香型白酒的獨特之處具有重要意義。本試驗采用沉香型酒醅為材料,通過對沉香型酒醅中芽孢桿菌的分離篩選,結合16S rDNA序列分析和固相萃取和氣質聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法對分離得到的芽孢桿菌進行產酶特性、溫度耐受性和產風味物質能力進行研究,旨在為沉香型白酒的發展提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品取自四川省瀘州市某常年生產沉香型白酒的酒廠,取上、下層出窖糟醅且均勻混合,置于冰盒中迅速運回,4℃保存。

干酪素、氯化鈉、可溶性淀粉、碘、異戊醇、0.1 mol/L磷酸鈉(Na3PO4)(均為分析純):成都科龍化工試劑廠；氯仿(分析純):重慶川東化工(集團)有限公司；飽和酚、20%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)、2%十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethylammonium bromide,CTAB)(均為分析純):北京索萊寶科技有限公司；0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)(分析純):美國Sigma-Aldrich公司。

可溶性淀粉培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,淀粉2 g,蒸餾水1 L,pH值調至7.2±0.1,121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,pH值調至7.2±0.1,121℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養基:牛肉膏3 g,酪蛋白10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,KH2PO42 g,溴百里香酚藍0.05 g,蒸餾水1 L,pH值調至7.4±0.1,121℃滅菌20 min。

玉米粉液體培養基[6]:玉米粉60 g,KH2PO43 g,蔗糖10 g,MgSO4·7 H2O 1.5 g,蒸餾水1 L,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZWYR-D2403搖床:上海智城分析儀器制造有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋:上海一恒科學儀器有限公司；Lynx6000高速落地離心機:賽默飛世爾科技有限公司；7890B 5977 GC-MS儀:美國Agilent公司；Mini-Subce11水平電泳儀、ChemiDoc XRS+化學發光成像系統:美國Bio-Rad公司；Precellys24均質機:法國Bertin Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中芽孢桿菌的分離

稱取25 g酒醅樣品,將其加入裝有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,置于搖床振蕩30 min,使菌體懸浮。

采用梯度稀釋涂布法分離酒醅中的芽孢桿菌,將菌懸液稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍并分別涂布于平板,37 ℃條件下培養24 h,將所觀察到的不同形態特征的菌落進行再次劃線純化,從平板中挑取少量單菌落進行革蘭氏染色,并將純化后所得菌種進行斜面保種,放置于4℃。

1.3.2 芽孢桿菌16S rDNA序列分析

(1)芽孢桿菌DNA提取

將不同形態的單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中,37℃、160 r/min搖床培養24 h,取2 mL培養液于離心管,13000r/min離心10min,去掉上清液,收集菌體沉淀(共2～3次)；向離心管中加入適量玻璃珠和700 μL DNA提取液,吹打振蕩使菌體重懸,加入50 μL 20%SDS,充分混勻后,用勻質器進行機械破壁；隨后加入750 μL酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,V/V),劇烈振蕩1min,靜置5min,13000r/min離心5 min；取上層清液于新的離心管,加入0.6倍體積的異丙醇,室溫下沉淀30min；13000r/min離心15min,棄掉上清液,加入1mL體積分數為70%的乙醇洗滌沉淀,13000r/min離心5 min后,棄掉上層乙醇溶液(重復一次)；放置于超凈臺吹風20 min,使DNA沉淀吹干,隨后加入100 μL雙蒸水使DNA溶解。

(2)DNA的擴增及PCR產物檢測

將1.3.2(1)所得到的DNA溶液作為擴增模板,采用通用引物27f-1492R進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增；25 μL反應體系:10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)2 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板0.3 μL,Taq酶0.5 μL,加雙蒸水至25 μL。擴增程序:94℃預變性4 min；94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環后,72℃延伸10 min。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳,成像對PCR產物進行檢測。

(3)測序結果分析

將測序結果與美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數據庫進行比對,選出序列同源性最高的序列,然后用Mega 5.0軟件構建系統發育樹。

1.3.3 溫度耐受性試驗

將牛肉膏蛋白胨液體培養基分裝10 mL至試管,滅菌待用,然后將不同菌株種子液(108CFU/mL)以2%的接種量加入試管,分別放于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃培養24 h,測定其吸光度值(OD600nm)。

1.3.4 產酶特性研究

(1)淀粉酶透明圈的測定

將活化好的菌用三點法點接到可溶性淀粉培養基培養48 h,觀察生長狀況,用0.5%的碘液(I2∶KI=1∶2)進行染色。并記錄其中3個透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算其平均比值(D/d)。

(2)蛋白酶透明圈的測定

將活化好的菌用三點法點接到酪蛋白瓊脂培養基上培養48 h,觀察生長狀況,并記錄其中3個透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算其平均比值(D/d)。

1.3.5 代謝產物分析

從平板上分別挑取一環菌體接種至100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基于37℃、160 r/min條件下培養24 h,再以2%(108CFU/mL)的接種量接入裝有100 mL玉米粉液體培養基的錐形瓶中,于37℃、160 r/min條件下培養40 h。結束發酵后,取5 mL玉米發酵液進行頂空固相微萃取,再用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析其代謝產物。

固相微萃取條件:在頂空瓶中加入5 mL玉米發酵液和2 gNaCl,55℃預熱15 min,萃取吸附30 min,GC解吸3 min,用于GC-MS分析。

氣相色譜(GC)條件:DB-WAX毛細管色譜柱(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度230 ℃；分流比100∶1；程序升溫:40℃保持3 min,6℃/min升至180℃,保持3 min,再以10℃/min升至230℃保持5 min；載氣:純度為99.999%氦氣,載氣流速:0.8 mL/min。

質譜(MS)條件:電離方式為電子電離(electron ionization,EI)源,電子能量70 eV,離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃,傳輸線溫度230℃,全掃描模式,掃描質量范圍25～500 amu,溶劑延遲3 min。

定性分析:質譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標準技術研究所(national institute of standards and technology,NIST)標準普庫05a.L進行比對,選擇匹配度均＞800(最大值為1 000)、特征離子進行定性分析[7]。并采用面積歸一化法進行定量分析,根據某一物質的色譜峰面積與總峰面積的比值求出其相對含量。

1.3.6 數據處理

試驗結果用平均值±標準差(xˉ±SD)表示,利用SPSS 20軟件對相關數據進行差異顯著性分析,運用Excel 2010進行作圖和建表。

2 結果與分析

2.1 酒醅中芽孢桿菌的分離

根據菌落形態差異并結合聞香法分離得到4株芽孢桿菌,編號為A、B、F、G,其菌落形態及菌株形態見圖1。結果表明,所得的4株菌革蘭氏染色菌呈紫色,即均為革蘭氏陽性菌且通過平板聞香均具有較好的香味。由圖1A可知,菌株A的菌落呈奶白色,菌落表面光滑且濕潤,易挑取；由圖1B可知,菌株B的菌落呈暗紅色,菌落扁平,表面光滑且濕潤,易挑取；由圖1F可知,菌株F的菌落表面干燥且有許多褶皺,菌落中心呈火山狀,不易挑取；由圖1G可知,菌株G的菌落呈淡黃色,菌落扁平粗糙,邊緣隆起。由此可確定分離所得的菌株均是不同的。

圖1 各菌株菌落及細胞形態Fig.1 Bacterial colony and cell morphology of each strain

2.2 芽孢桿菌16S rDNA序列分析

4株芽孢桿菌16SrDNAPCR擴增的電泳圖如圖2所示,PCR產物片段大約在1 500 bp左右,條帶很亮無明顯拖尾,陰性對照無條帶,說明反應體系無污染,故滿足測序要求。

圖2 4株芽孢桿菌16S rDNA PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA of 4Bacillusstrains

圖3 菌株A、B、F、G 16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of strains A,B,F and G

將測序結果在NCBI數據庫中進行16S rDNA序列同源性比較,選取同源性≥99%的菌株序列,運用Mega 5.0軟件構建系統發育樹,結果見圖3。由圖3可知,菌株A為阿式芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai),菌株B為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),菌株F為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),菌株G為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.3 芽孢桿菌的溫度耐受性試驗

通過在不同溫度條件下對所得菌株A、B、F、G進行培養,結果見圖4。由圖4可知,菌株A、F、G在40℃時都能生長良好,但隨著溫度升高,OD600nm值急劇下降,50℃時,幾乎不生長了。而菌株B卻有所不同,在50℃時,OD600nm值最大,生長的最好。這表明菌株B的耐熱能力較好,具有一定的嗜熱性,在相對高溫的條件下也具有很強的生長能力,耐高溫細菌在白酒釀造中也是重要的優勢菌之一。這與吳群等[8-9]關于地衣芽孢桿菌的耐熱性研究和描述是一致的。

圖4 不同溫度下各芽孢桿菌的生長狀況Fig.4 Growth status ofBacillusstrains under different temperature conditions

2.4 芽孢桿菌的產酶特性

2.4.1 芽孢桿菌的蛋白酶透明圈試驗結果

各芽孢桿菌產蛋白酶的透明圈如圖5所示,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)結果如圖6所示。由圖6可知,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)在2.2～3.4,其中菌株B的蛋白酶的D/d值最大,達3.4,其次是菌株G,經多重比較分析,菌株B和G所產蛋白酶的D/d值顯著高于其他兩株菌(P＜0.05)。從而可以表明,菌株B和G在一定程度上具有較高蛋白酶活力[10]。微生物通過產生蛋白酶水解原料中的蛋白質,不僅可以攝取營養更利于自身生長,還可以產生使酒體風味更豐滿的醇類物質[11]。

圖5 各芽孢桿菌產蛋白酶透明圈結果Fig.5 Translucent circle results of protease produced byBacillusstrains

圖6 不同芽孢桿菌菌株產蛋白酶D/d值比較Fig.6 Comparison of D/d values of protease produced by differentBacillusstrains

2.4.2 芽孢桿菌的淀粉酶透明圈試驗結果

各芽孢桿菌菌產淀粉酶的透明圈如圖7所示,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)結果如圖8所示。由圖8可知,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)在1.8～2.9,其中菌株B的淀粉酶D/d值最大,達2.92,顯著高于其他3株菌(P＜0.05),而菌株F和G淀粉酶D/d值差異不顯著(P＞0.05),但顯著高于菌株A淀粉酶D/d值(P＜0.05)。故菌株B產淀粉酶能力較好。

圖7 各芽孢桿菌產淀粉酶透明圈結果Fig.7 Translucent circle results of amylase produced by differentBacillusstrains

圖8 不同芽孢桿菌菌株產淀粉酶D/d值比較Fig.8 Comparison of D/d values of amylase produced by differentBacillusstrains

結合溫度耐受性試驗可見,菌株B不僅在高溫條件下能穩定生長,蛋白酶和淀粉酶透明圈D/d值也是最大的,這說明菌株B在釀造過程中具有更好的生長代謝能力且在高溫條件下具有很大的優勢。故可推斷菌株B在沉香型酒醅發酵過程中具有很大積極的作用。

2.5 芽孢桿菌的發酵產物分析結果

根據1.3.5節的方法對各菌的發酵液中的風味物質進行了分析,并與空白培養基相比較,分析了4株芽孢桿菌發酵產物中的風味物質,總離子流色譜圖見圖9,各風味物質含量鑒定結果見表1。

圖9 不同芽孢桿菌菌株發酵液中風味物質的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.9 Total ion chromatograms of flavor compounds in fermentation broth of differentBacillusstrains analysis by GC-MS

表1 不同芽孢桿菌菌株發酵液中風味物質的GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis results of flavor compounds in fermentation broth of differentBacillusstrains

由圖9及表1可知,4株芽孢桿菌分別一共檢測得到23種物質,其中主要包括醇類、酸類、酮類和其他化合物。對各菌發酵產物進行分析發現,3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇是各菌的主要產物,二者之和分別占各菌發酵液的32.1%、52.7%、58.1%、75.4%,且3-羥基-2-丁酮具有特有奶油香味,是廣泛使用的食用香料,廣泛存在于水果、肉類等許多食品中[12],3-羥基-2-丁酮還是釀造過程中美拉德反應的前驅物質和傳統食品發酵中重要的風味物質四甲基吡嗪合成的前提物質,也是中國白酒風味中重要的微量成分之一[13]。此外,菌株A較其他3株菌產3-甲基戊酸和異丁酸的能力更強,分別占35.5%和9.6%。菌株B、F產3-甲基丁酸的能力也較強,分別占29%和12%。具有特殊芳香氣味的愈創木酚只在菌株B、F發酵液中被檢測出來,且菌株F發酵液中還檢測出了少量的乙酸(0.95%)和具有芳香氣味的甲酸異丙酯(2.043%)；此外,僅在G菌發酵液中檢測出了少量的濃香型白酒重要的風味物質丁酸(1.355%)和己酸(0.542%)。這些物質均是白酒中重要的風味成分,但不同的菌株所產的風味物質又具有一定的差異性,使得風味更加豐富。通過分析檢測出的風味物質,發現了吡嗪合成所需的前體物質3-羥基-2-丁酮,而吡嗪類物質對醬香型白酒風味具有重要貢獻；此外,還檢測到了乙酸、丁酸、己酸等有機酸,這些有機酸是合成乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯的重要底物,也是清香型白酒和濃香型白酒的風味成分之一。綜合來看,基本符合沉香型白酒清、濃、醬香氣馥郁的風味特點。由此可見,沉香型酒醅中篩選所得的產香芽孢桿菌對沉香型白酒獨特風味的形成具有非常重要的作用。

3 結論

沉香型酒醅中分離篩選得到4株產香能力較好的芽孢桿菌,分別鑒定菌株A為阿式芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、菌株B為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、菌株F為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、菌株G為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。阿式芽孢桿菌能快速高效的溶解難溶性磷[14],且具有較強的抗輻射能力[15],這將會為發酵環境提供更多的有效磷,有利于某些微生物生長代謝。而菌株B、F、G都是與產醬香有關的重要細菌[16-17]。其中菌株B地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)具有較強的耐高溫的能力,在50℃也能穩定生長,且其在淀粉酶和蛋白酶試驗中水解圈D/d值均最大；芽孢桿菌屬(Bacillussp.)對環境的適應力極強,廣泛存在于釀造環境中,是各類酶系的重要產生菌,同時也是酒體風味物質的主要產生菌,對白酒的生產和風味均有重要作用。

通過對各芽孢桿菌發酵產物進行分析,一共檢測得到23種物質,其中主要包括醇類、酸類、酮類和其他化合物。其中3-羥基-2-丁酮、乙酸、丁酸、己酸等風味物質的特征可基本體現沉香型白酒清、濃、醬香氣馥郁的風味特點。

通過本試驗可說明沉香型酒醅是多菌復合發酵并相互作用產生多種具有特殊風味物質的場所,由于不同菌株產風味物質的不同,使得風味物質種類更加豐富。將分離篩選出的優良產香菌株加入沉香型白酒釀造過程中,對沉香型白酒的風味形成及酒質的提高都具有重要的指導意義。

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